[发明专利]一种低氮排放的工程菌发酵制取有机磷水解酶的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种工程菌发酵表达方法，尤其是发酵制取有机磷水解酶的方法。

背景技术

现代社会的发展离不开农药的使用，但大面积的农药使用，使得农药残留问题日益成为困扰现代人的心病。为此，中国科学院动物研究所培育了超级工程菌[E.coli BL-21(DE3)携带质粒pETDuet-opd-b1]，并采用发酵诱导外源基因表达获得的有机磷水解酶，能有效降解水果、蔬菜的甲基对硫磷、对硫磷、甲胺磷、氧化乐果等有机磷农药农药的残留，也可以作为土壤、水体农药污染的修复剂，是现代生物工程的成果之一。为了能得到良好的表达效果，在发酵中都采用氮过量控制，常规工艺多采用LB培养基或在此基础上的衍生的配方，氮源主要是胰蛋白胨和酵母粉，虽然生产性能良好，但其发酵废液的BOD通常高达10000以上，对环境造成伤害，同时这也是约束发酵行业发展的一个瓶颈。

发明内容

本发明的目的是克服上述背景技术的不足，提供一种工程菌发酵制取有机磷水解酶方法的改进，该方法应在保持发酵水平的同时，具有污染排放少、污染处理负荷低的的特点，并且工艺简单、操作方便。

本发明提供的技术方案如下：一种低氮排放的工程菌发酵制取有机磷水解酶的方法，依次按以下步骤进行：

一种低氮排放的工程菌发酵制取有机磷水解酶的方法，依次按以下步骤进行：

1)菌种选择

选用工程菌(E.coli BL-21(DE3)携带质粒pETDuet-opd-b1)作为制取有机磷水解酶的菌种；

2)培养斜面菌种

斜面培养基中的成分及重量比：葡萄糖0.1％，酵母浸出粉1％，蛋白胨1％，磷酸氢二钾0.12％，磷酸二氢钾0.04％，氯化镁0.1％，氯化钠0.3％，琼脂粉1.5-2.0％，其余为蒸馏水；调节PH至7.1后进行灭菌，灭菌条件为2kg/cm2(绝对压力)蒸汽20～30分钟，后冷却至60℃以下，使培养基保持无菌环境；接种量为1接种环接2个9厘米标准培养皿或3支试管斜面；斜面培养时间为18～36小时；

3)培养一级菌种

培养基中含有：蛋白胨10g，酵母浸出粉3g，硫酸铵10g，葡萄糖10g，磷酸氢二钾1.2克，磷酸二氢钾0.4克，氯化镁1克，氯化钠5g，复合溶液1mL；加蒸馏水定容至1000ml后，调节PH至6.8；取100～400毫升培养基置于三角瓶中，用纱布封口后灭菌，灭菌条件为2kg/cm2(绝对压力)蒸汽10～30分钟；灭菌后保持无菌状态；接种量：每支斜面菌种接入3瓶培养基；培养：旋转式摇床100～210转/分，培养温度34℃～36℃，培养时间17～30小时；培养结束后显微镜镜检，菌体应大小一致，无杂菌感染，OD600净生长值应大于2.0(波长为600nm时的光密度值)；

4)发酵罐内培养二级菌种

培养基中的成分及重量比：蛋白胨0.3％，酵母浸出粉0.1％，硫酸铵2.0％，葡萄糖2.0％，磷酸氢二钾0.17％，磷酸二氢钾0.06％，氯化钠0.3％，其余为蒸馏水；每升培养基中加复合溶液1毫升，调节PH至7.0；装酵后灭菌，装酵量为种子罐有效容积的60％，灭菌条件是115℃蒸汽10～30分钟；灭菌后保持无菌状态；接种量：一级菌种用量是培养基重量的5％；培养温度34℃～36℃，培养时间15～30小时；罐压2kg/cm2；搅拌转速(发酵罐内搅拌桨转速)100～400转/分；保持罐内相对溶氧大于50％；通风量：体积比1∶0.5～1.5(体积比的定义是培养基与每分钟通入的空气的比例；1升培养基1分钟通入1升空气为1∶1)；培养结束后，显微镜镜检，菌体应大小一致，无杂菌感染，OD净生长值应大于2.0；

5)发酵罐内发酵

培养基中的成分及重量比：酵母浸出粉0.05％-0.1％，硫酸铵0.5％-1.0％，氯化铵0.5％-1.0％，葡萄糖0.3％-1.0％，氯化钠0.1％-0.3％，磷酸氢二钾0.1％-0.17％，磷酸二氢钾0.03％-0.06％，其余为蒸馏水；每立方米培养基加一升复合溶液加，调节PH至7.0；装罐后灭菌，装罐量为发酵罐有效容积的70％，灭菌条件为115℃蒸汽10～30分钟；接种量：二级菌种用量为培养基重量的1～10％；发酵时的起始风量：体积比为1∶0.5～1.5；保持相对溶氧大于50％直至相对溶氧不再增加时，将发酵液泵入冷冻贮罐内，迅速降温到4℃，结束发酵。

6)酶粉提取

(1)向发酵液中加入0.01％～0.05％重量比的聚乙烯醇，充分搅拌，16000rpm离心分离菌体，清液处理后排放；