[发明专利]一种径向流色谱脱除粗多糖中蛋白质的方法

说明书

(一)技术领域

本发明属于多糖分离纯化技术领域，具体涉及一种脱除粗多糖中蛋白质的方法。

(二)背景技术

多糖作为一种生物活性制品，一般需要分离纯化到一定纯度后才能更好地发挥作用，尤其是要将其开发成对纯度要求较高的药品时，除去其中所含杂蛋白是一个必不可少的纯化步骤。对于多糖针剂制品而言，更是必须脱除多糖中的蛋白质，否则蛋白质容易成为热敏源。另外，对多糖结构作进一步分析与鉴定时，也要求必须除去蛋白质。活性多糖主要是天然植物多糖和一些真菌多糖，这些多糖组分具有不同的生理、生化效应。

油菜是世界四大油料作物之一，居我国油料作物之首。油菜可提供丰富的食用油，同时，也为饲料工业提供了丰富的菜籽饼粕资源。菜籽饼粕中的化学成分复杂，含多糖、蛋白、植酸、多酚等。研究表明菜籽多糖可通过自身的还原性保护生物体内的其他还原性成分，从而发挥抗氧化作用，另外其还具有降血糖、增进免疫等生物活性。

在众多活性多糖物质中，最令人瞩目的要数真菌多糖，它们存在于香菇、金针菇、黑木耳、灵芝、茯苓、蘑菇和猴头菇等大型食用菌中。灵芝多糖是灵芝中最有效的成分之一，已知的灵芝多种药理活性大多和灵芝多糖有关。灵芝多糖能提高机体免疫力，提高机体耐缺氧能力，消除自由基，抑制肿瘤，抗辐射，提高肝脏、骨髓、血液合成DNA、RNA、蛋白质能力，延长寿命，灵芝多糖还具有刺激宿主非特异性抗性、免疫特异反应以及抑制移植肿瘤生理活性的特性。

目前国内外脱除多糖中蛋白质的方法常用的有：Sevag试剂法、三氟三氯乙烷法、三氯乙酸法(TCA法)、1％鞣酸法，这些方法是向多糖溶液中加入一定比例的有机溶剂，如Sevag试剂、三氯乙酸、三氟乙酸、鞣酸等来达到去除蛋白质的目的；另外常用的方法还有酶-Sevag联用法及大孔树脂吸附法等。其中，Sevag试剂法是经典的脱蛋白方法，其条件比较温和，但此法需反复数十次才能除去尽量多的蛋白质，而且该方法还存在多糖损失严重、有机试剂用量大、耗时较长、成本高等问题；另外，生产过程中分液后，多糖溶液中仍残留有毒性较大的有机溶剂，还需蒸发去除残留的有机溶剂。

径向流色谱法(Radial Flow Chromatography，RFC)是近十年来发展起来的一种新型的色谱分离分析技术。径向流色谱柱由两个多孔渗透树脂玻璃同心圆筒及介于两者之间的色谱分离介质构成，主要包括内、外树脂玻璃圆筒、分离介质、树脂玻璃顶板和底板、以及不锈钢中心流体分布器等组件，采用独特的径向流动设计，流动相携带样品沿径向迁移，不同于传统轴向色谱柱的流体在柱内从一端流向另一端。从而克服了传统色谱技术操作压力高、流速低、在大规模处理时不便放大等缺点，具有操作压力低、流速高、线性放大容易及处理量大等突出优势。

在用色谱法分离纯化生物样品时，为增加制备量，一般需要对柱结构和尺寸进行相应的调整：一是保持色谱柱的长度不变，增加色谱柱的直径；二是保持色谱柱的直径不变，增加色谱柱长度，这两种方法在一定程度上都可以增加样品制备量。然而在传统轴向色谱柱中，随着色谱柱长度的增加，柱压相应增加，样品保留时间延长，对柱子的要求也增加，同时也给实际分离操作带来诸多不变。而对于径向流色谱来说，由于它特殊的径向流动设计，使得其在只增加柱长，保持色谱柱直径不变的情况下，即可线性增大样品处理量，即样品处理规模可在保持相似色谱条件下直接放大，各组分保留时间及分辨情况基本相同。因为保持径向色谱柱的直径不变时，样品通过色谱柱内填料的途径也未改变，因此分离过程基本保持一致；同时，由于色谱柱的长度增加，色谱柱的柱容量也增加，从而处理量就线性增大。

(三)发明内容

现有脱除粗多糖中蛋白质的方法存在有机溶剂消耗数量巨大、多糖损失严重、成本高、操作周期长、污染环境，且对操作人员伤害较大等问题，因此，本发明的目的是提供一种能快速、高效、经济、安全脱除多糖中蛋白质的方法。

本发明的技术方案如下：

本发明提供一种脱除粗多糖中蛋白质的方法，所述的方法是首先将含有蛋白质的粗多糖配成10～30mg/ml水溶液，离心取其上清液，然后将该上清液过装填有阳离子交换树脂的径向流色谱柱，以纯水为洗脱剂进行洗脱，控制上样流速1～3ml/min，洗脱流速为5～20ml/min，收集洗脱液，直至洗脱液中无糖检测出为止，合并收集的洗脱液经后处理制得纯品多糖。

本发明方法的依据是，提取获得的粗多糖在自然pH值下具有其所含多糖一般呈中性而蛋白质带电的性质，可利用离子交换树脂与具有相反电荷的生物分子起相互交换吸附的性质来实现粗多糖中蛋白质的脱除。