[发明专利]捻转血矛线虫微粒体氨肽酶基因的获得方法及应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种捻转血矛线虫浙江株微粒体氨肽酶基因的获得方法及其用途。

背景技术

捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)是牛、羊等反刍动物的主要寄生性线虫，引起的捻转血矛线虫病每年给我国农业生产带来数以百万计的经济损失。药物防治是控制该病的主要方法，但线虫耐药性的日益严重以及药物残留的出现制约了已有抗线虫药物的长久使用。疫苗研制作为一种新的防治策略已成为研究的热点。

微粒体氨肽酶H11是一种分子量在110kDa的完整膜糖蛋白复合物，仅在寄生阶段的小肠微绒毛上表达。H11属于微粒体氨肽酶家族，该复合物具有氨基肽酶A和M活性。通过分子克隆以及序列分析，H11基因的3个亚型已经得到鉴定，每个分子亚型均具有膜内在蛋白质二型结构，即拥有一个短的N-末端细胞质尾巴，一个跨膜区以及一个胞外区。

H11具有很高的免疫保护水平，但由于体外试验还很难模拟H.contortus的寄生生活阶段，不能实现H.contortus的实验室培养，其天然提取物远不能满足疫苗生产的需要，使得利用天然抗原提取物进行疫苗研制变得举步维艰。因而，具有同等免疫活性的重组形式的研究具有重要的现实意义。但是到目前为止，利用H.contortus疫苗候选抗原的重组形式进行的免疫试验均未取得理想效果。

H11的重组形式仅能提供很小的免疫保护。利用重组杆状病毒转化昆虫细胞表达的H11的可溶性形式H11S免疫山羊，可以获得高水平的抗体，该抗体能够与天然的H11发生交叉反应，也能够抑制天然H11和重组H11的氨基肽酶活性，但是却不能针对H.contortus的感染提供有效保护。同时研究发现，利用大肠杆菌表达H11的活性位点区域，获得的重组蛋白以无活性的包涵体形式存在，能够诱导山羊机体产生一定的免疫保护力，但由于免疫保护力太低，并没有实际应用价值。利用H11活性位点区域的蛋白免疫后，产生的抗体能够与天然H11产生交叉反应，抗体水平存在较大的个体差异，与减卵率具有一定程度的相关性。然而，该抗体却不能抑制H11的氨基肽酶活性。昆虫细胞与大肠杆菌表达系统获得的(部分)重组蛋白，抗原性质与酶活性具有明显的差异，这表明抑制氨基肽酶活性并不是H11提供免疫保护的机制。

如何提高H11重组形式的免疫保护性成为众多学者关注的焦点，掌握H11启动子的活性，了解H11转录水平或翻译水平上的调控规律或许能够为我们提供一定的参考，而国内外目前还未见有关H1l基因组结构分析的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种获取捻转血矛线虫(H.contortus)微粒体氨肽酶基因的方法，也即捻转血矛线虫(H.contortus)浙江株H11基因cDNA序列以及相应基因组序列的分子生物学方法，通过以下技术方案实现：

(1)H.contortuss浙江株总RNA的抽提和H11cDNA序列的克隆；

所述的H.contortus浙江株总RNA的抽提和H11cDNA序列的克隆：参照Smith(1997)发表的H.contortus H11基因序列设计引物(见SEQ NO 1和SEQ NO 2)，以H.contortus浙江株的总RNA为模板，进行RT-PCR扩增。将PCR产物与PUCm-T载体连接后，转化DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，测序(见SEQ NO 3)。

(2)H11 cDNA序列同源性比较及氨基酸序列分析；

H11 cDNA序列同源性比较及氨基酸序列分析：利用生物软件DNAStar对获得的H11基因进行基本的特征分析，并与Smith等克隆的H1l进行同源性比较(见SEQ NO 4)。

(3)H11基因组序列的克隆及结构分析；