[发明专利]生物催化法制备2,2-二甲基环丙甲酰胺及其菌株

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一株具有高腈水合酶活性的菌株及其在生物催化法制备2，2-二甲基环丙甲酰胺中的应用。

(二)背景技术

腈是一类含氰基官能团的化合物，在有机合成中具有非常重要的地位。氰基是一种重要的C1源，通常作为“水稳定负碳离子”被引入有机物中，形成胺、亚胺、酰胺、脒、羧酸和羰基化合物等。但是，传统的腈化学转化具有能量消耗大，反应条件苛刻，需要强酸或强碱、高温和金属催化剂，反应选择性低等缺点，并伴随大量副产物的形成。腈化合物也存在于自然环境和细菌、真菌、植物、动物中，在生物系统中，已知的腈水合酶、腈水解酶、酰胺酶催化腈转化成对应的酰胺和羧酸。腈生物转化与生物催化提供了许多传统化学方法不能或者不易合成得到的手性化合物的合成方法，并显示出优良的选择性，而且，生物转化反应条件温和、转化率高、产物纯度高、产物提炼相对容易，符合绿色化学发展方向。

2，2-二甲基环丙甲酰胺是制备西司他丁手性前体S-(+)-2，2-二甲基环丙甲酰胺(S-(+)-2，2-dimethylcyclopropanecarboxamide)的关键原料(U.S.5,273,903，U.S.5,427,934)，2，2-二甲基环丙甲酰胺生产方法分为化学合成法和生物转化法。化学法合成2，2-二甲基环丙甲酰胺具有反应条件苛刻、反应步骤冗长、副产物多、产物得率低和废水多等缺陷。利用腈水合酶催化2，2-二甲基环丙甲腈水合制备2，2-二甲基环丙甲酰胺能够克服化学合成工艺的缺陷，符合原子经济和可持续发展(有机腈生物代谢途径见图1)。

(三)发明内容

本发明目的是克服现有的2，2-二甲基环丙甲酰胺生产技术的不足，提供一种从土壤及污水中富集、筛选高腈水合酶活性微生物菌种——Rhodococcus boritolerans FW815，以及应用该菌株进行生物催化法制备2，2-二甲基环丙甲酰胺的工艺。

本发明采用的技术方案是：

Rhodococcus boritolerans FW815，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学430072，保藏编号CCTCC No：M 208108，保藏日期2008年07月14日。经鉴定，该菌株属于红球菌属(Rhodococcus)的boritolerans种(无准确中文命名)，菌株编号为FW815。

该新菌株的特征如下：

菌落形态：在固体牛肉膏蛋白胨培养基上，30℃培养2天，菌落呈圆形，直径约2毫米，中央隆起，边缘光滑、整齐，呈淡黄色，随着培养时间延长，菌落颜色逐渐变深至淡红色。

细胞形态：细胞呈直的短杆状，0.8～1.2×0.2～0.5微米，细胞以单个出现，无芽孢形成，不运动。

生理生化特征：革兰氏染色阴性，甲基红试验阴性；液体石蕊牛奶培养基中培养有反应，硝酸盐还原阳性，反硝化作用阳性，产硫化氢，柠檬酸盐利用阳性，明胶水解阳性，酪氨酸水解阳性，酪素水解阳性，尿酶阳性，过氧化氢酶阳性，β-半乳糖苷酶阳性，卵磷脂酶阳性，丙二酸盐实验阳性，精氨酸脱羧酶阳性；淀粉水解阴性，鸟氨酸脱羧酶阴性，赖氨酸脱羧酶阴性；培养基中存在铁离子条件下，腈水合酶阳性。

16S rDNA序列分析：以提取到的细胞总DNA为模板，利用引物：p16S-8：5′-aga gtt tgatcc tgg ctc ag-3′和p16S-1541：5′-aag gag gtg atc cagccg ca-3′扩增菌株的16S rDNA基因，将基因产物同T载体连接，经测序确认该片段实际长度为1476bp，该菌与菌(Rhodococcus boritolerans)的同源性最高(homology，99.93％/1445bps，based on 16S rDNA)。

综合上述鉴定结果，该菌株属于Rhodococcus boritolerans。

本发明涉及的微生物菌株R.boritolerans FW815是通过以下程序筛选获得的：