[发明专利]具有α-苯乙醇拆分活性的嗜热脂肪酶、编码基因及其应用

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种具有α-苯乙醇拆分活性的嗜热脂肪酶及其编码基因，以及该嗜热脂肪酶的制备方法和应用。

(二)背景技术

脂肪酶(lipase，E.C.3.1.1.3)全称为三酰基甘油水解酶(triacylglycerol)，是指能在油水界面上水解甘油三酯的酶。它是能催化酯水解和酯合成的水解酶中最重要的一类。脂肪酶具有较宽的作用温度、较强的底物专一性及立体选择性等特点，其催化的反应不需辅酶，反应条件温和，副产物少，因此已广泛应用于食品加工、洗涤剂、造纸、皮革加工、制药、污水处理等行业。由于大多数的工业反应都在超过45℃的温度下操作，这就要求酶具备较好的热稳定性(Bonch-Osmolovskaya，E.A.，Miroshnichenko，M.L.，Kostrikina，N.A.etal.，Arch.Microbiol.，154，1990：556～559。)，来源于一些嗜热菌的嗜热脂肪酶不仅具有常温酶的高效催化的优点，而且在高温条件下能保持很高的稳定性，对有机溶剂及变性剂有很强的抗性，因此在许多领域，如食品工业、环境保护、能源以及石油开采等方面都具有潜在的重要的应用价值。

随着对手性药物和中间体需求的增长，利用生物法或酶法拆分手性化合物来合成单一对映体日益得到人们的重视。脂肪酶是目前生物催化中最广泛应用的酶类，其中手性化合物的拆分(Racemate resolution)是其主要应用方向。脂肪酶对醇、羧酸、酯、酰胺和胺等手性化合物均有较好的立体选择性，因此脂肪酶被广泛地用来拆分外消旋醇和羧酸。拆分的主要途径为立体选择性水解、酯化或转酯反应。通过筛选找到适用的具有高对映体选择性的新型脂肪酶酶以制备光学纯的手性化合物已经成为研究热点。在同一生物体内往往存在多种水解酶，但它们的立体选择性存在差异，因此利用微生物细胞或粗酶制品进行催化时会降低产物的光学纯度(Geun-Joong Kim，Journal of Molecular Catalysis B：Enzymatic 17，2002：29～38)。Fernandez-Lorente G等人把Aspergillus niger脂肪酶纯化后其对0-2-丁酰基-2-苯乙酸外消旋体的立体选择性大大提高了(Fernandez-Lorente G et al， Purification of different lipases from Aspergillusniger by using a highly selective adsorption on hy

(三)发明内容

本发明的目的是提供一种在高温条件下显示活性的嗜热脂肪酶及其编码基因，同时提供了由重组菌株制备脂肪酶的方法，以及纯化的脂肪酶在苯乙醇的手性拆分的应用。

本发明采用的技术方案是：

一种具有α-苯乙醇拆分活性的嗜热脂肪酶，所述嗜热脂肪酶的氨基酸序列与SEQ ID No.2所示氨基酸序列具有90％以上同源性。

优选的，所述嗜热脂肪酶具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。

本发明还涉及编码所述嗜热脂肪酶的基因。

优选的，所述基因具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，该基因编码SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。

本发明研究证明，嗜热脂肪芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)T2产生的脂肪酶作用温度范围为40～80℃，pH 5～11，最佳温度为55℃。该脂肪酶在许多抑制剂如EDTA、PMSF、DTT和β-巯基乙醇的存在下都能保持稳定，Triton-X 100能较大地提高酶活。将脂肪酶与许多有机溶剂如乙醇、甲醇、异丙醇、丙酮、DMSO共保温后，酶活基本未损失，其中乙醇还能明显地提高酶活，说明该脂肪酶对有机溶剂具备良好的耐受性。

本发明通过筛选获得了具备脂肪酶活力的嗜热脂肪芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)T2，从上述菌株中提取基因组DNA后，通过PCR技术扩增得到了脂肪酶基因lip T2，测序结果表明其长度为1251bp，编码一个由416个氨基酸组成的蛋白质。其核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示，相应的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。应当指出，本发明的脂肪酶不仅限是具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质，也包括对序列2中的氨基酸进行一个或多个氨基酸残基的取代、插入或缺失且具有相同酶活性的蛋白质。

本发明还涉及一种制备所述嗜热脂肪酶的方法，所述方法包括：

(1)构建含有编码所述嗜热脂肪酶基因(lipT2)的表达载体；