[发明专利]血筛试剂中特异性核酸提取方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及到特异性核酸序列的设计，纳米磁珠的包被方法，病毒的裂解。

背景技术

基于磁性微粒(微纳米磁珠)的核酸纯化技术是利用亲水性磁性微粒吸附样品溶液中的核酸分子，在外加磁场作用下将负载核酸的磁性微粒从样品溶液中分离出来，经适当清洗后，加入适当的溶液使得核酸从磁性微粒上脱附即得到纯化核酸。

磁性微粒(微纳米磁珠)由γFe₂O₃和Fe₃O₄磁性材料合成的均一、超顺磁、单发散性多聚微球。每个微球体包被一层多聚材料，作为吸附和结合各种分子的载体。微纳米磁珠形状和大小的均一性为其本身与靶物质之间提供最佳的反应动力学，这就大大方便了它们之间快速、高效的结合。球形、确定的表面减少了化学粘附和非特异性结合。均一的微球表面保证了目标探针的有效使用和最佳结合。由于磁珠是超顺磁的，它们能够在磁场中表现出磁性而在无磁场时无磁性，便于分离磁珠和液体样本。目前，微纳米磁珠在核酸纯化过程中被广泛应用，使得核酸纯化的基本步骤实现了自动化，无需进行乙醇沉淀、苯酚/氯仿萃取、离心和柱层析处理，从而避免连续重复的手工抽提，不仅减少了样品损失与污染，还极大地提高了样品处理的通量。基于磁性微粒的核酸分离纯化试剂盒以其操作简便快捷和省时省力的特点，成为目前分子生物学和临床医学研究的理想的辅助工具。

由于普通的微纳米磁珠表面包被了一层硅酸盐材料，通过氢键、范德华力等作用结合样本中的核酸，在提取纯化过程中能够吸附所有的核酸，是一种非特异性的提取，洗脱后得到的是多种核酸的混合物，会对后面的PCR扩增以及其他样本的处理造成很多干扰，特别是在要求高灵敏度的血液筛查试剂中，会因各类病毒核酸序列的同源性造成检测结果的假阳性。

发明内容

本发明的目的是提供一种可广泛用于血液筛查的特异性核酸提取方法。以满足血筛HBV、HCV和HIV病毒提取的要求。

本发明的血筛试剂中特异性核酸提取方法，其特征是包括以下步骤：

1)在含有链亲和素的1.5～100μm微纳米磁珠上包被HBV、HCV和HIV特异核酸序列；

2)将包被有特异核酸序列的微纳米磁珠和血液样本中HBV、HCV和HIV病毒裂解出来的核酸杂交；

3)使用核酸纯化仪分离磁珠和血液样本，洗涤磁珠，用洗脱液从磁珠上洗脱HBV、HCV和HIV病毒核酸；

4)通过荧光定量PCR检测病毒含量。

本发明中，所说的HBV、HCV和HIV特异核酸序列如下：

HBV特异核酸序列：5′-TGCTGCTGCCTCATCCTTGTC[biotin]-3′

HCV特异核酸序列：5′-AGTAGTTCCTCACAGGGGAGT[biotin]-3′

HIV特异核酸序列：5′-TGGCTGCTTGATGTCCCCCCAC[biotin]-3′

上述的含有链亲和素的1.5～100μm微纳米磁珠为商品化产品。

本发明使用的微纳米磁珠是一种均一、超顺磁的微球体，在其表面共价结合纯化的链亲和素。链亲和素是一种由四个相同的亚基组成的蛋白质，每个亚基均有一个与生物素有高亲和力的结合位点。这种链亲和素与生物素的高亲和力(Kd＝10-5)可以快速、高效地分离生物素标记的靶分子，而不会出现像抗生物素蛋白那样的非特异性结合。生物素—链亲和素的相互作用的稳定性和结合力可以对DNA分子进行诸如解链、洗脱、杂交等操作，而不影响DNA在纳米磁珠表面的稳定性。根据GeneBank中HBV、HCV和HIV病毒序列数据库设计核酸序列探针，使其覆盖HBV、HCV和HIV的所有亚型。因此将经过生物素标记的HBV、HCV和HIV核酸序列探针结合到这种微纳米磁珠上，得到特异性提取HBV、HCV和HIV的微纳米磁珠。DNA病毒和RNA病毒经过裂解液同时裂解，核酸游离在溶液中，加入特异性微纳米磁珠分离纯化病毒核酸。跟非特异提取磁珠相比，采用本发明有利于提高核酸提取的特异性，避免因各类病毒核酸序列的同源性造成检测结果的假阳性，使得检测结果更准确。

本发明的优点在于：

本发明采用特异性核酸提取方法，有利于提高核酸提取的特异性，避免因各类病毒核酸序列的同源性造成检测结果的假阳性，使得检测结果更准确。本发明方法可广泛用于血液筛查。

具体实施方式

以下结合实施例进一步说明本发明。