[发明专利]通过使用闭合吸管玻璃化方法低温贮藏人胚泡来源的干细胞

说明书

本申请是申请号为2004800124278、发明名称为“通过使用闭合 吸管玻璃化方法低温贮藏人胚泡来源的干细胞”、申请日为2004年5 月10日的发明申请的分案申请。

发明领域

本发明涉及用于玻璃化生物学细胞，特别是胚泡来源的干细胞 (BS细胞)的改进方法。所述方法对解冻后仍保持活性的细胞是非常 温和的。

发明背景

干细胞是具有自我更新和产生特化或分化细胞之独特能力的细 胞类型。尽管绝大部分体细胞，例如心脏细胞或皮肤细胞，负责行使 特定功能，但干细胞在其接收到发育成特定细胞类型的信号之前功能 未定。形成所述干细胞独特性的是其增殖能力以及其发生分化的能力。 多年来，研究人员致力于寻找使用干细胞替代受损或病变的细胞和组 织的方法。目前，大部分研究集中于两种类型的干细胞，胚胎干细胞 和体细胞干细胞。胚胎干细胞来源于胚胎植入前的受精卵母细胞，即 胚泡，而所述体细胞干细胞存在于成熟生物体中，例如骨髓、表皮和 肠内。根据许多欧洲和其它国家的国家法律，受精卵在植入子宫前即 受精后10-14天并不被认为是胚胎，因此当如本发明应用时，这类细 胞在此处被称为胚泡来源的干细胞或hBS细胞。多能性检验已显示尽 管所述胚胎或胚泡来源的干细胞可产生生物体内的所有细胞，包括生 殖细胞，但体细胞干细胞具有更有限的衍生细胞类型集库。

1998年，研究人员第一次能从人受精卵母细胞中分离出胚胎干细 胞并将其培养在培养基中，参见例如美国专利5 843 780和美国专利6 200 806。

在干细胞技术领域中越来越多的研究和进展需要获得适合于保 存所述细胞和细胞系的方法。细胞可通过玻璃化或冷冻贮藏。由于细 胞外冰的形成具有破坏作用，因此使用常规方法的低温贮藏很难应用 于复杂和敏感的生物学材料。经过玻璃化过程，含有所述细胞的样品 被快速冷却至极低的温度，水容物不结晶而形成的玻璃样态。因此， 玻璃化是在无冰晶形成的情况下快速冷冻液体介质的方法。无定形玻 璃在直接将例如含有细胞的吸管放入液氮中的快速冷冻过程中形成。 所述玻璃保持液体的正常分布但以过冷却的形式保存。所述玻璃避免 了冰晶并且所述细胞免受与冰晶形成相关的细胞损害。因此，将玻璃 化定义为避免晶核形成和生长的无定形玻璃样态的固化。

曾经对人胚胎干细胞低温贮藏进行研究并且Reubinoff等人 (Human Reproduction，2001，16，2187-2194)描述了通过使用开口抽拉 式吸管玻璃化方法进行低温贮藏这些细胞的方法。所述方法的缺点是 其涉及到吸管的开口端与液氮接触，这可能会成为将要被玻璃化的生 物材料的污染源。此外，由于抽拉吸管的大小，Reubinoff等人进行 玻璃化的体积约为1μl。

用于避免与氮直接接触的玻璃化方法已在Lopez-Bejar等人 (Theriogenology，2002，58：1541-52)对兔胚胎和Chen等人(Human Reproduction，2001，16(11)：2350-56)对小鼠卵母细胞的应用中得以描 述。这些方法都使用了与已知的开口抽拉吸管相同的抽拉方式并因此 而拥有与Reubinoff等人使用的抽拉吸管具有相同大小的封闭抽拉吸 管。因此，在这些方法中，各吸管中玻璃化的体积约都为1-2μl。

慢速冷冻和快速解冻方法曾用来低温贮藏细胞系。尽管这些方法 适合用来低温贮藏例如小鼠胚胎干细胞，但对于未分化的人胚胎干细 胞的存活率似乎很低，而且绝大部分所述细胞分化或死亡。通常，用 这种慢速冷冻方法玻璃化较大体积的细胞会导致较低的恢复率 (Reubinoff等人)。

因此，仍就需要发展易于操作、涉及尽可能少的步骤而同时在所 述过程中避免或至少减少对所述细胞不想要的污染之风险的有效玻璃 化方法。特别地，需要发展用于细胞或细胞系(例如hBS或hBS细胞 系)的较大体积玻璃化的有效方法。

发明描述

如上所述，有效的低温贮藏方法是胚泡来源的干细胞系产生和广 泛应用、并在此之下建立人胚泡干细胞库所必须的。有效的冷冻和解 冻技术能够有效地保存细胞和细胞系。为了一些目的，希望在每一根 吸管中进行大体积玻璃化。例如当在给定的步骤(或应用)中需要大量 的细胞或当细胞将以其玻璃化状态通过邮寄进行派送时就是这种情 况。

本发明涉及用于细胞玻璃化的方法，包括