[发明专利]一种构建cDNA文库的方法

说明书

技术领域

本发明公开一种构建cDNA文库的方法，利用T-载体快速构建cDNA文库是 基因工程技术中的一种分离鉴定功能基因的方法，属分子生物学范畴。

背景技术

构建cDNA文库是鉴定未知生物基因组功能基因的一种有效手段，从1975 年Rougeon等人第一次成功构建cDNA文库以来，各种构建文库的方法不断涌现， 技术手段也越来越成熟，其主要的技术手段不外乎包括：采用polyd(T)寡聚糖 核苷酸与mRNA的poly(A)互补配对为引物，以mRNA为模板通过RNA反转录酶 催化合成第一条cDNA链。然后通过DNA聚合酶合成第二条cDNA链。为了将合 成的cDNA克隆到载体中，通常需要在双链cDNA两端加上两个带有特异酶切位 点的接头引物，另外为了在酶切接头引物时不至于将cDNA切断，往往需要将所 合成的cDNA甲基化。切割完成后连接到载体中，最后进行cDNA文库构建。这 些方法都涉及到接头引物和酶切等复杂程序，操作太繁琐，且成功率不是很高， 更不能轻易采用对微量宝贵样品建库。虽然最近也有采用噬菌体插入/切除位点 特异性重组系统(即GATEWAY^TM系统)连接cDNA到载体的报道，但这种重组的效 率是有待提高的，而且用于重组的酶非常昂贵，在推广上有一定难度。 总之，现在还没有一种既简单经济，又快速高效，既不需要大量RNA样品，又 能高通量、高成功率的构建cDNA文库的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种构建cDNA文库的方法，既不需要核酸内切酶也不 需要噬菌体插入/切除位点特异性重组系统的构建cDNA文库的高通量、高成功 率的简单方法。

本发明的目的是这样实现的：

包括以下步骤：

1、

1)以总RNA或mRNA为模板，以SEQ ID No.1和SEQ ID No.2为引物，以 Invitrogen公司的SuperScript II为反转录酶合成cDNA第一条链；

2)以cDNA第一条链为模板，以SEQ ID No.1和SEQ ID No.2为引物，以DNA 聚合酶通过PCR扩增合成双链cDNA；

3)将步骤2)合成的双链cDNA直接通过T4DNA连接酶连接到T-载体中， 将载体通过转化导入大肠杆菌，得到cDNA文库。

2、步骤1)SEQ ID No.1为一段寡聚脱氧核苷酸序列，3’末端为GGG，其余 序列为任意一段特异性接头引物序列。

3、步骤1)SEQ ID No.2为一段寡聚脱氧核苷酸序列，3’末端为15-30个胸 腺嘧啶脱氧核苷T和VN序列，5’末端为明显不同于SEQ ID No.1的任意一段 15-30bp的特异性接头引物序列。

4、步骤2)用于合成双链cDNA的DNA聚合酶为具有添加腺嘌呤脱氧核苷A粘 性末端功能的Taq DNA聚合酶。

5、步骤3)所述的T-载体指两端都带有突出胸腺嘧啶脱氧核苷T粘性末端的 载体。

本发明的核心步骤为使用Taq DNA聚合酶通过PCR合成cDNA的第二条链， 利用Taq DNA聚合酶在DNA合成完成后的加尾特性，保证合成的双链cDNA两个 末端均为A粘性末端，这样的双链DNA可以在T4-DNA连接酶作用下和带有两个 T粘性末端的T-载体连接，之后通过转化完成cDNA文库的构建。

如图1所示，该发明的具体实施步骤如下：

A.第一条链的合成

将以下药剂加入灭菌过的无菌离心管中：

1-3μl    RNA样品(大约1.0μg总RNA)

1μl     引物SEQ ID No.1

1μl     引物SEQ ID No.2

加双蒸水至5μl

将离心管里的溶液充分混合并稍微离心使之聚集，然后72℃温浴2分钟，然 后放置冰上2min。然后加入以下试剂：

2.0μl      5X第一条链缓冲液

1.0μl      DTT(20mM)

1.0μl      dNTP Mix(10mM)

1.0μl      SuperScriptII反转录酶

总体积为10.0μl

将离心管里的溶液充分混合并稍微离心使之聚集，然后42℃温浴60分钟。反 应完成后，将离心管放在冰上终止反应。

B.通过PCR合成cDNA第二条链