[发明专利]对虾白斑综合征病毒VP37p多肽片段与应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种对虾白斑综合征病毒(WSSV)基因的核苷酸序列。具体地说，本发明涉及对虾白斑综合征病毒VP37的核苷酸序列片段(VP37p)，还涉及由该核苷酸部分序列编码的一种具有粘附活性的多肽。本发明还涉及这些多核苷酸和多肽的应用，以及所述多核苷酸和多肽的生产方法。

背景技术

对虾白斑杆状病毒(WSSV)是近年来危害我国及亚洲太平洋地区人工养殖对虾的主要病毒原之一，它能高致死率地侵染绝大多数种类的对虾，此外还可侵染淡水及海洋生态系统中多种蟹类、龙虾类、端足类、水蝇类等甲壳纲动物，具有较广泛的宿主范围，因此它不仅严重危害对虾养殖，还对海洋生态造成了影响。WSSV是双链DNA病毒，基因组全长305Kb，是迄今为止发现的最大的动物病毒(J Virol 200175：11811-11820)。基因组序列遗传及形态学特征都表明WSSV是一种新病毒，它不属于目前已知的任一种病毒家族，因此国际病毒分类委员会将WSSV归属为新的Whispovirus属，Nimaviridae种(www.ncbi.nlm.nih.gov/ICTVdb/Ictv/index.htm)。由于这是一个全新的病毒，而且WSSV基因组较大，所以绝大多数WSSV病毒结构蛋白与其他病毒没有同源性，因此这些蛋白的功能无法通过与其他病毒蛋白的同源性分析进行预测，因而使WSSV功能研究具有极大的难度。已有20余个基因初步确证其功能，尚有许多基因的功能未知。目前还难以对WSSV进进预防和控制，一方面由于WSSV能在自然环境中存活长时间，更重要的是人们对此病毒分子水平的了解还很少。粘附是病毒粘附蛋白与细胞受体的结合过程，粘附启动病毒与宿主细胞的相互作用，是建立感染、损伤细胞的必然途径。病毒入侵宿主细胞前的识别和粘附是引发感染的关键步骤，病毒只有与细胞受体结合才能进入扩增循环。近期的研究结果表明，WSSV感染宿主细胞的初期，必须具有完整囊膜结构，表明WSSV感染宿主细胞初期必须首先经过一个亲和吸附和相互作用的过程。阻断这一过程，将可能达到抑制WSSV感染的目的。目前已有应用WSSV囊膜蛋白作为疫苗防止WSSV的专利，包括利用WSSV的VP28，VP26，VP24，VP19等。WSV254编码的多肽片段活性分析表明VP37p不仅是WSSV的一种囊膜蛋白，而且为WSSV感染虾体的粘附蛋白片段，更进一步指出是RGD位点在起作用。本发明的创新处在于，应用粘附蛋白多肽片段从阻断WSSV与宿主相互作用控制WSSV的感染。

发明内容

本发明中的编码VP37p序列是如此获得的。以纯化的WSSV基因组DNA作为模板。根据WSV254序列的一部分(133bp-299bp)设计合成SEQ ID No.3和SEQ ID No.4的序列作为引物，经PCR扩增获得了WSV254的部分序列SED ID No.1的序列。然后通过重组表达VP37p基因，纯化VP37p基因的表达产物，通过ELISA方法与荧光标记的方法，确定其与对虾细胞的结合活性，动物活体实验分析其在甲壳动物抗WSSV感染抑制的作用。在本发明被公布之前，尚没有任何人公开过本申请中涉及的VP37p序列。

本发明的目的是提供一种新的WSSV多肽，它包括：具有SEQ ID No.2氨基酸序列的多肽，或者其活性片段，或其活性衍生物。较佳，该多肽是具有SEQ ID No.1序列的多肽。此蛋白被命名为VP37p。

本发明的另一个目的是提供一种利用重组技术生产所述的VP37p的方法。

本发明还提供了VP37p的应用，即蛋白疫苗，其含有VP37p编码序列，以及药学上可接受的载体。更明确的，本发明的这种疫苗含有SEQ ID No.2中所述的氨基酸序列或其衍生序列。

此外，本发明的核酸序列可以被用来制造核酸疫苗，对甲壳动物进行接种，以抗WSSV感染。载体疫苗包括活的减毒细菌或病毒疫苗，以及药学上可接受的载体。

在本发明的一个具体实施方案中，本发明中分离的多核苷酸全长为167个核苷酸，其详细序列见SEQID No.1，其中开放阅读框位于1-167位核苷酸。

另一方面，本发明还包括对VP37p DNA或是其片段编码的多肽能特异性相互作用的多克隆抗体、单克隆抗体及其它能抑制VP37p基因产物或片段。

本发明的技术方案如下：

1.WSSV-VP37p基因的制备：

(1)WSSV病毒基因组的制备：将提纯的病毒置于0.2mg/ml蛋白酶K和1％月桂酰肌氨酸钠中，在65℃中静置2h。用氯仿和苯酚抽提后将得到的产物溶于50μl TE。-20℃保存，作为PCR扩增模板。