[发明专利]一种由Pseudoalteromonas sp.MYX44生产的к-卡拉胶酶

说明书

技术领域

生物技术

背景技术

有关卡拉胶酶的报道并不多见。早在1943年，Mori就从海洋软体动物中提取到能够水解角叉菜卡拉胶的酶。海洋假单胞菌Pseudomonas carrageenovora是最早研究的能够产生卡拉胶酶的微生物。该酶在对κ-卡拉胶降解的过程中，使其粘度迅速下降，还原糖含量增加，降解产物以4-硫酸-新卡拉二糖为主。现在已经在假单胞菌、噬纤维菌属Cytophaga、别单胞菌属A.carrageenovora及某些未鉴定菌种中发现到卡拉胶降解酶。Luk’yanov等(1994)从红藻Chondrus，Polysiphonia，Tichocarpus等分离到100株细菌，其中25株菌具有卡拉胶降解活性。

目前的研究已经确定κ-卡拉胶酶属于16族糖苷水解酶，κ-卡拉胶酶的分类号E.C.3.2.1.83，为专一性内切酶，专门水解α-3，6-内醚-D-半乳糖和β-4-硫酸-D-半乳糖之间的β-1，4-糖苷键。Sarwar等1987年报道用2216E培养基添加商业0.1％卡拉胶培养海洋细菌Cytophaga sp.1k-C783，分离胞外卡拉胶酶。用硫酸铵沉淀、离子交换色谱、凝胶过滤色谱纯化得到κ-卡拉胶酶，纯化的酶分子量用SDS/PAGE电泳测定为100kDa。Potin等1991年报道从红叶藻属(Delesseria sanguinea)分离了一株能够降解不同硫酸化的半乳糖聚合物(琼胶或卡拉胶)的细菌，用硫酸铵、凝胶过滤色谱(Sephacryl S-200 HR)、离子色谱(DEAE-Sepharose-CL6B)纯化κ-卡拉胶酶，用SDS/PAGE电泳检测为单一蛋白质。测定酶分子量为40kDa。Araki(1999)从海藻表面分离到κ-卡拉胶酶产生菌——海洋弧菌CA-1004，通过硫酸铵盐析和层析技术使从发酵液中分离的卡拉胶酶纯化分子量为35kDa。pI和Km值分别达到9.2和3.3mg/ml。

发明内容

本发明的目的是提供一种来源于海水的菌株Pseudoalteromonas sp.MYX44并利用该菌株制备的κ-卡拉胶酶以及相关的酶学性质。

本发明分离纯化出一株来源于海水的菌株Pseudoalteromonas sp.MYX44，其具有产生κ-卡拉胶酶的特性，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保藏号为CCTCC M 207151。保藏日期2007年9月25日.保藏单位地址：中国武汉，武汉大学.发明的特点是：

首次分离出产κ-卡拉胶酶Pseudoalteromonassp.MYX44菌株。该菌株为不产孢子的杆状，革兰氏阴性。不抗酸，没有荚膜，氧化酶阳性，无色素。0.8-1.2μm×1.8-2.2μm，端生单鞭毛。该菌株来源于海水，为氧化型糖代谢，3％和7％NaCl胨水中生长良好，经过生理生化特征和16S r DNA基因序列测定鉴定为Pseudoalteromonas序列表1，但是未能给出具体种，暂命名Pseudoalteromonas sp.MYX44。为此菌株在2216E培养基上26℃培养24h形成单菌落，菌落乳白色，圆形，边缘整齐。该菌株具有营养要求范围广，容易培养和培养时间短的特点。在发酵培养基中培养28h，其发酵液中κ-卡拉胶酶的活力达到最高(32℃下测定)。用本发明的菌株作为κ-卡拉胶酶的生产菌株，具有产品的活性高、稳定性好、生产周期短、成本低的特点，能够实现工业化生产。通过酶的分离纯化，将纯化的酶蛋白单一组分进行N端测序得到20个氨基酸的序列经检索不同于已经报告的κ-卡拉胶酶。判定其为一个新的κ-卡拉胶酶。

附图说明

纯化的κ-卡拉胶酶SDS-PAGE电泳结果。左边为标准蛋白分子量，右边为Pseudoalteromonas sp.MYX44生产的κ-卡拉胶酶纯酶单带，表示数量单位为：kDa。

具体实施方式

1.菌株的分离纯化：