[发明专利]用于检测和测定黄芩苷的抗体、方法和试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及小分子半抗原的抗体及其制备方法与应用，特别是涉及黄芩苷及其衍生物的抗体及其制备方法与应用。

背景技术

本发明涉及用于检测和定量黄芩苷的方法和试剂盒，以及其中使用的半抗原、免疫原、偶联物(conjugate)和抗体。

其中“检测”是指定性分析物质是否存在。

其中“测定”是指对物质进行定量分析。

黄芩苷中药黄芩的主要有效成分，有消炎抗菌、退黄、降谷丙转氨酶(ALT)及抗过敏的作用。其抗变态反应的机制可能系抑制肥大细胞巯基酶的活化，从而抑制组胺、5一羟色胺等过敏反应介质的释放。部分病人应用本品后血清IgG、1gM浓度上升，表明特异性体液免疫作用增强。临床用于急性、慢性迁延性和慢性活动性肝炎，也可用于肾炎、肾盂肾炎及过敏性疾病等。

目前建立了多种黄芩苷的定性与定量检测和测定分析方法，如薄层层析法、HPLC法，HPLC-MS法等。其中最常用的方法是高效液相色谱法。但含黄芩苷的生物样品(包括血浆、尿、唾液等)含有大量的影响含量测定的蛋白质及内源性物质；同时黄芩苷可能呈结合状态，必须经过处理，排除内源性杂质和代谢物的干扰，使结合状态的黄芩苷游离后才能测定；同时还需要浓缩以满足仪器检测灵敏度的要求，处理程序复杂，费时费力；同时由于黄芩苷进入体内后，组织中的分布是极其微量的，即使经过富集，进行含量测定仍是极其困难的。另外，对于黄芩苷在靶器官和组织中分布，以及细胞和亚细胞定位的研究，需要通过免疫组织化学和western-blot等方法，但由于缺乏黄芩苷的抗体，阻碍了此方面的研究。因此，有必要开发出一种用于检侧和测定生物样品中黄芩苷的方法，对阐明相关药材或复方的作用机理，以及其体内分布和代谢研究，将具有特别的价值。

发明内容

本发明的半抗原黄芩苷可提供确定的结构性抗原决定部位，但是它本身并不具备免疫原性，因此必须要偶联到适宜的赋予抗原性的载体物质上，这样所形成的免疫原才会在注射到宿主动物体内后诱发免疫应答。因此，本发明提供一种如下结构的免疫原：

其中R是0至6个碳的烷基桥(连接半抗原与载体物质的桥)，优选R＝0，即P1直接与绿原羰基碳原子结合，或R是C1-C6取代或未取代的、直链或支链的、饱和或不饱和的亚烷基，更优选R是C1-C4未取代的、直链的、饱和的亚烷基。

P1是赋予抗原性的载体物质。载体物质选自蛋白质、蛋白质片合成的多肽或半合成的多肽。其中蛋白质、蛋白质片段选自白蛋白、血清蛋白、球蛋白、目镜蛋白和脂蛋白，优选为牛血清白蛋白、卵清蛋白、牛丙种球蛋白、甲状腺素结合球蛋白、锁眼形血蓝蛋白(keyholelimpet haemocyanin，KLH)，更优选自锁眼形血蓝蛋白或牛血清蛋白(BAS)。合成多肽或半合成多肽是具有足够数量的可利用氨基的合成聚氨基酸，优选多聚赖氨酸。合成或天然聚合物是带有反应官能基的聚合物材料，特别是能够结合到半抗原产生免疫原的碳水化合物、酵母或多糖。

半抗原的制备 本发明描述了半抗原黄芩苷在羧基处或任一羟基处与赋予抗原性的载体物质发生的偶联作用，产生免疫原。为了让半抗原的结构特征充分暴露，可在-COOH位点上接上一个连接臂。据此以黄芩苷为起始原料，同时以氯化亚枫，氨基丁酸或氨基己酸等为原料，经过二步反应，合成了半抗原2和3。产物2和3纯化后分别经质谱(MS)和核磁共振氢谱和碳谱(1HNMR和13CNMR)确证。

免疫原的合成 本发明的半抗原和蛋白质载体的连接可使用本领域己知的任何连接方式。例如但不限于碳二亚胺法(EDC)、戊二醛法等。采用碳二亚胺法制备缀合物和免疫原时，是将0.2毫摩尔的半抗原黄芩苷溶解在N，N-二甲基甲酰胺中，加入1.5当量的二环已基碳二亚胺和3当量的N-羟基琥珀酰亚胺，室温下反应过夜，离心，取上清液加入到10-20mg/mL的牛血清蛋白碳酸盐缓冲溶液中，搅拌反应1-6小时，装入透析袋，分别用蒸馏水和0.01mol/L的PBS缓冲溶液透析3-5d，分装保存于-20℃的冰箱中。

合成免疫原的分析方法 为了确认载体物质上结合有适当的半抗原，在免疫前，使用紫外分光度法或矩阵辅助紫外激光解析/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)对每个免疫原进行评估。黄芩苷免疫原反应物和产物的吸收峰相比(200nm-400nm)，可判断是否偶合，并根据反应物和产物的摩尔吸光系数计算偶联物与半抗原的比例。