[发明专利]一株高产脂肪酶的解脂亚罗酵母突变株、培养方法及其酶应用

说明书

【技术领域】

本发明涉及生物技术领域，具体地涉及高产脂肪酶的解脂亚罗酵母菌株，发酵培养方法，及其发酵获得的脂肪酶或发酵液在催化脂肪酸甲酯化反应中的用途。

【背景技术】

解脂亚罗酵母菌株又称解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)，属半子囊酵母菌，是非常规酵母菌之一，已应用于生产脂肪酶、单细胞蛋白、柠檬酸、异丙基苹果酸等。它产生的脂肪酶广泛应用于工业、轻工业、食品、医药等领域。

脂肪酶能够将脂肪酸甘油酯催化水解为游离脂肪酸、甘油二酯、甘油单酯、甘油，此外还能催化醇或酯与甘油酯之间的转酯化反应，脂肪酸与醇之间的酯化反应，具有广泛的应用价值，已成为市场上的第三大工业用酶。但现有的产脂肪酶的解脂亚罗酵母菌株产酶单位偏低，工业化成本偏高。

随着能源危机、环境污染的加剧，生物柴油作为替代能源是以可再生资源为原料，同时具有环境污染小的优点，成为研究开发的热点，并达到了一定规模的实际应用。脂肪酶催化生物柴油合成，具有方法简单、条件温和、能耗低、副产物价值高的优点。目前，应用于生物柴油生产的脂肪酶开发不多。NOVA公司垄断经营的脂肪酶成本高，不适合催化反应器进一步放大。因此，在我国乃至世界生物柴油生产的工业化过程中，急需获得酶活单位高，生产成本低廉的工业化脂肪酶生产菌株。

本专利使用紫外照射方法对野生型Yarrowia lipolytica出发菌株进行诱变，并将常规筛选方法加以改进，得了高产脂肪酶的突变菌株 LW1。经本专利所述方法发酵得到的发酵液酶活最高达到15500u/ml。该菌株及其培养方法提高了脂肪酶的产生量，适合工业化生产，能催化脂肪酸甲酯化等酶法催化生产生物柴油领域。使用专利所述方法得到的高酶活的发酵液还可以制成不同酶活的脂肪酶制剂，可以作为产品向市场销售，因此具有较高的经济价值。

【发明内容】

[要解决的技术问题]

本发明的第一个目的是提供一种高产脂肪酶的解脂亚罗酵母菌株(Yarrowia lipolytica)LW1(CGMCC No.2707)，又称解脂耶氏酵母。

本发明的另一个目的是提供所述高产脂肪酶的解脂亚罗酵母菌株LW1的发酵培养方法。

本发明的另一目的是提供所述脂肪酶的制备方法。

本发明的另一目的是提供所述脂肪酶与所述发酵液在其催化脂肪酸甲酯化方法中的用途。

[技术方案]

本发明是通过下述技术方案实现的。

本发明涉及紫外诱变选育得到解脂亚罗酵母菌株(Yarrowialipolytica)LW1。

根据本发明，以从中国农业大学食堂周围环境中分离得到的解脂亚罗酵母野生型为试验菌株，通过紫外线诱变的方法，以改良的透明圈筛选方法进行初筛，摇瓶复筛得到了脂肪酶高产解脂亚罗酵母菌株(Yarrowia lipolytica)LW1。

本发明的高产脂肪酶的解脂亚罗酵母菌株(Yarrowialipolytica)LW1，该菌菌株已于2008年10月14日，寄存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区大屯路，编号CGMCC No.2707，它具有以下微生物学特性：

1)、麦芽汁培养基：在28℃下生长48小时后，细胞呈长椭圆形假丝酵母状。

2)、PDA固体培养基上的玻片培养物：良好的假菌丝体形成。

3)、无孢子形成。

4)、划线培养物：灰白，顶端凸起，表面构造有褶皱。

5)、最适培养温度：28℃

6)、能够利用的碳源：利用葡萄糖、甘油，不利用淀粉、蔗糖。

7)、kNO₃同化作用：无

本发明还涉及所述高产脂肪酶解脂亚罗酵母菌株LW1的诱变选育方法，其特征在于该方法的步骤如下：

A、制备野生型出发菌株菌悬液

以从中国农业大学食堂周围环境中分离得到的野生型解脂亚罗酵母为出发菌株，依次经PDA固体培养基在28℃下活化1次，PDA液体培养基在28℃下活化2次，然后按照以重量计5％接种量接种入PDA液体培养基，在温度28℃下培养12h，然后取1ml菌液加到10ml已灭菌的以重量计0.86％NaCl水溶液中，得到野生型菌株菌悬液。所述的PDA培养基与下述的PDA斜面培养基相同。

所述野生型解脂亚罗酵母培养所使用的培养装置是本技术领域的技术人员熟知的培养装置。例如所述野生型解脂亚罗酵母固体培养装置是恒温培养箱；所述野生型解脂亚罗酵母液体培养装置例如是恒温振荡摇床。