[发明专利]一种棒状链霉菌、其制备方法及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物制药领域，涉及一种棒状链霉菌，特别是一种通过基因工程方法构建的棒状链霉菌。本发明还涉及所述棒状链霉菌的制备方法及应用。 

背景技术

β-内酰胺类抗生素，如青霉素、头孢菌素、头霉素，是临床上应用最广泛的抗生素品种。但是，由于病原菌耐药性的出现，此类抗生素的使用大受影响。病原菌出现耐药性的主要原因是其产生的β-内酰胺酶，β-内酰胺酶通过破坏β-内酰胺类抗生素的β-内酰胺环而使其失活。克拉维酸是棒状链霉菌产生的天然β-内酰胺酶抑制剂，能够不可逆的结合β-内酰胺酶的丝氨酸活性位点而保护β-内酰胺类抗生素的活性。临床上克拉维酸常与β-内酰胺类抗生素复配使用，能够有效地增强β-内酰胺类抗生素的抗菌活性及扩大抗菌谱。其中以阿莫西林/克拉维酸钾复方制剂应用的最为广泛，曾经连续13年位列世界畅销药排行榜。 

克拉维酸的生产菌为棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus)，目前国内的菌种生产能力很低，在菌种选育时主要采用传统的方法。传统的菌种选育方法主要是采用紫外诱变和化学诱变，这些方法耗时长，随机性大，工作量大，并且很多具有遗传优势和代谢优势的生物突变种群由于突变的随机性而难以鉴定和分离。国内提高克拉维酸产量的另一途径主要是优化发酵条件，但其所能提高的产量有限。由于克拉维酸发酵产量低，生产工艺复杂，化学合成法尚未实现工业化，我国的克拉维酸制剂一直以来主要依赖进口，因此大幅度提高其生产菌株产酸量是当前克拉维酸制剂开发中的一项重要任务。 

随着重组基因工程技术的发展，越来越多的研究将其应用于调控生物的代谢途径，特别是那些具有重要商业价值的工业生产用微生物。微生物细胞在生长代谢过程中，自身会合理、经济地利用和合成各种能量和物质，使其处于平衡生长状态。然而，相对于生产应用来说，细胞原有的代谢调控网络是不合适的。为了积累某种代谢产物，更好的应用于生产，就必须改变原有的代谢调控网络，就需要对代谢途径进行修饰。利用分子生物学原理系统分析细胞代谢网络，并通过重组DNA技术合理设计细胞代谢途径及遗传修饰，进而完成细胞特性的改造，这就是代谢工程。 

代谢工程被视为第三代基因工程技术，是继传统的蛋白质多肽多基因表达(第一代基 因工程)和基因定向突变(第二代基因工程)之后的一个崭新科学领域。它是分子生物学、微生物学、遗传学和分子反应动力学等多学科的发展及相互渗透的结果，是国内外研究的热点。它针对细胞代谢途径个所属反应在基因水平上的表达与调控，利用重组DNA技术扩增、删除、植入和调控代谢途径相关的基因，从而得到具有优良遗传特性的工程菌。例如，可以通过增加那些编码合成途径中的限速酶的基因拷贝数来增加目的代谢产物的产量。利用这种方法在选育高产菌株时针对性强，省时省力。 

克拉维酸(clavulanic acid，CA)属于次级代谢产物，1978年Elson用C¹³标记物研究CA的合成途径，酯酸盐可形成CA分子的一部分五碳骨架(碳2，3及8，9，10)，甘油可提供β-内酰胺环(碳5，6，7)的碳骨架。随后研究发现，鸟氨酸与精氨酸均可有效掺入CA(碳2，3，8，9，10)。Valentin等利用不能将精氨酸转变为鸟氨酸的argF、argG突变株为研究菌株，发现精氨酸为CA的直接前体。标记的甘油、甘油酸、丙酸盐和β-羟基丙酸盐均可掺入到CA(碳5，6，7)，但乳酸或甘油酸二位碳上的氢却不能掺入，说明这两种物质在掺入前均需被转变成丙酮酸盐。随着CEA合成酶(催化精氨酸和三碳单元的连接)被分离纯化，研究者发现此酶以D—3—磷酸甘油醛为底物。因此，尽管其它三碳物质可能最终有不同的利用效率，但显然D—3—磷酸甘油醛是CA分子中三碳单元的直接前体。综上所述，克拉维酸生物合成前体中，C₃单位来源于甘油或它的代谢产物，或其它途径来源的磷酸烯醇型丙酮酸，但D—3—磷酸甘油醛应该是克拉维酸分子中三碳单元最直接前体物；C₅单位来源于TCA循环的中间物α—酮基戊二酸的转化产物——谷氨酸、鸟氨酸和精氨酸，其最适合的前体物以精氨酸更为直接(见附图1)。