[发明专利]抗高尔基体蛋白单克隆抗体及应用

说明书

技术领域：

本发明涉及抗高尔基体蛋白抗体及其应用。具体涉及抗人高尔基体蛋白(以下简称为GP73)的特异性单克隆和多克隆抗体，以及用所述的单抗和多抗制备不同检测方法的多种GP73检测试剂的应用。 

背景技术：

目前肝癌的诊断主要依靠血清肿瘤标志物检测、影像学和组织学检查，其中甲胎蛋白(AFP)是目前临床诊断原发性肝细胞癌的最主要实验室指标。AFP虽为诊断肝癌的首选指标，但其敏感性在33％～85％之间(平均为56.3％)，特异性为30.9％～80％(平均为55.4％)。在肝癌的早期，约有30％～50％的患者AFP呈阴性或水平较低。寻找敏感性高、特异性强的肿瘤标志物，对于肝癌的早期诊断、改善病人的预后是十分必要而迫切的。 

高尔基蛋白73(Golgi protein 73，GP73)是新近发现的一个分子量为73KDa，定位于高尔基体上的II型跨膜糖蛋白。采用免疫组化的研究方法证实在人类的上皮细胞有着GP73的少量表达，而在正常的肝脏中，GP73仅在胆管上皮细胞表达，肝细胞基本不表达。但是病变的肝组织，特别是在肝癌的早期，GP73呈现过表达并且其表达水平与肝癌的进展程度相关。 

最新的研究显示，GP73的胞外段经过蛋白酶切，可以从高尔基体膜上释放到细胞外，并且采用Western-Blot或是质谱(SELDI-TOF MS)的方法，在肝癌病人的血清中可以检测到GP73。通过对Western蛋白条带灰度的半定量分析发现，在肝癌特别是早期肝癌的诊断上，其敏感性为69％～76.9％(平均73％)，特异性为75％～92％(平均为83.5％)，明显优于AFP，因此国内外的学者认为GP73有望成为取代AFP的一个新型肝癌诊断标志物。但是Western和质谱这两种检测方法具有以下缺点：一是不易进行准确定量，第二是费时且操作不便，因两种方法均过于专业化，只能作为实验室小样本理论研究，不适宜用于大样本、高通量的筛选和应用型研究，难以将GP73用于临床肝癌病人诊断。 

相对于Western blot等方法，酶联免疫吸附试验(ELISA)具有敏感性更高、易操作、结果可以客观定量并且可以重复测定便于动态监测和费用相对低廉等优点，而被广泛应用于 临床病人多种肿瘤标志物的血清学检测。 

目前上市的抗GP73抗体多为多克隆抗体，是采用人工合成的GP73氨基或羧基末端的一段多肽免疫动物后获得的血清。如Santa Cruz Biotechnology，Inc所售的抗GP73的多克隆抗体，是用合成的GP73氨基或羧基末端的一段多肽免疫山羊后获得的。而目前所见的抗GP73单抗则是针对所有II型高尔基膜蛋白而非特异性针对GP73这一种蛋白所制备出来的。 

目前尚无以重组人GP73蛋白为抗原制备抗GP73多抗和单抗，也未见采用双抗体夹心ELISA检测肝癌病人血清中GP73的报道。 

发明内容：

本发明的目的是制备抗GP73多克隆抗体和特异性针对GP73的单克隆抗体，并且将所制备的单克隆抗体用于GP73的定性及定量检测，特别是用酶联免疫吸附试验等多种不同方法检测血清样本中GP73的含量。 

本发明分别采用重组人GP73蛋白免疫家兔获得了抗GP73多克隆抗体；免疫小鼠后经杂交瘤技术和多轮筛选后获得了特异性针对GP73的单克隆抗体(anti-GP73mAb，取名为6A2)。 

制备上述抗GP73单克隆抗体所用的杂交瘤细胞，命名为6A2。已经在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC—C200815，保藏时间：2008年4月22日。 

所述抗GP73单克隆抗体6A2，其重链与轻链可变区如SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：4所示。其中： 

SEQ ID NO：1是抗GP73单克隆抗体重链可变区DNA序列； 

SEQ ID NO：2是抗GP73单克隆抗体重链可变区氨基酸序列。 

SEQ ID NO：3是抗GP73单克隆抗体轻链可变区DNA序列； 

SEQ ID NO：4是抗GP73单克隆抗体轻链可变区氨基酸序列。 

本发明用上述抗GP73单克隆抗体6A2作为捕获抗体，用上述抗GP73多克隆抗体为检测抗体，建立了检测GP73蛋白的双抗体夹心ELISA法，具体操作方式如下： 

1.用抗GP73单克隆抗体包被ELISA板，4℃过夜； 

2.用PBST洗涤3次后，加入1％脱脂奶粉37℃封闭1.5小时；