[发明专利]肺炎球菌的抗原及配体管式PCR检测试剂盒及其制备和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测试剂盒，尤其涉及一种肺炎球菌的抗原及配体管式PCR检测试剂盒及其制备方法和应用。

背景技术

早期蛋白质检测是以抗体同特定待检物蛋白质的低解离常数和一定的特异性为基础，采用简易方便的筛选方法——抗体捕捉法。该法是检测样品中有无抗原：首先将抗原包被于固相支持物，然后用抗体去结合抗原形成复合物，冲洗去掉未结合的抗体，最后用和结合抗体特异识别的标记分子去检测结合抗体；也可以抗原、抗体先反应形成复合物后，再结合到固相支持物上，然后检测复合物。许多抗体捕捉法是利用间接法来检测抗体，如检测抗体是鼠抗体，则检测分子可能是带检测标记的兔抗鼠抗体，所用的传统检测标记包括放射性同位素、染料和作用于底物产生可检测分子如色原的酶。

酶联免疫吸附剂测定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)是广为人知的免疫检测法，传统的ELISA技术似三明治夹心法，即两抗体共同结合到某一抗原——捕捉抗体，将其同样品中的抗原结合，再加入同抗原结合的偶连酶的检测抗体，然后反应形成捕捉抗体—抗原—检测抗体“三明治”复合物，最后测偶连酶活性显示检测结果。虽然抗体检测法具有较大的应用价值，但是它的检测范围受捕捉抗体和抗原反应的解离常数(Kd)值限制。在实践中，检测低限大约是Kd值的1％，当待分析物浓度降低到这个可能检测极限时，所捕捉到的待分析物抗体百分率将不足以产生相对于信噪比的可检测信号。因此，用荧光或化学发光检测系的抗体检测法的检测下限约1pg/ml(10-4M对平均分子量50,000道尔顿的蛋白质)。

随着基因技术应用的快速发展，在抗原抗体检测方面已有较多的基因检测技术。

核酸待测物的检测要求不同于抗体检测的技术。在二十世纪八十年代中期，DNA技术的研究发现了通过酶重复扩增过程可扩增DNA的方法，后来叫聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)：首先加入两互补的寡核苷酸序列(叫引物)，它将结合在所要扩增的区域的两侧，然后加热变性，在降温退火过程中让引物同互补序列结合，再加入Klenow片段DNA聚合酶I以延伸引物，通过重复变性、退火、延伸所希望的片段，目标DNA就会以指数方式扩增。PCR曾经过许多改进，一个重要的变化是耐热聚合酶(即Taq聚合酶)的应用，它产于温泉中嗜热菌，具有热稳定性，几乎不被PCR变性中高温影响，所以不必像应用不耐热的Klenow聚合酶I，每一次变性后得补加聚合酶。

在以PCR作为扩增系统的运用中，产生了免疫-PCR方法。该法是把特定待测物连接到微孔板上，然后用PCR扩增放大能力来检测——例如小牛血清白蛋白(BSA)被动吸附到一免疫检测板上，加入对BSA的特异抗体(连有蛋白A链亲和素融合蛋白及生物素标记的报告扩增子)，PCR后用琼脂糖电泳分析报告扩增子，可检测到几百个BSA分子，但这种方法不能实现定量检测，同时因为缺乏待测物的特异捕捉分子，也不能用于生物样品检测。为此，人们不断对其进行改进：首先用生物素化第二抗体和一个连接生物素化报告扩增子的链亲和素融合蛋白，然而5种试剂的加入、洗板、扩增、检测很费时费力，而且解离复杂；随后又把报告扩增子共价连到第二抗体上，虽然直接连接减少了试剂数目和解离复杂性，但仍需要PCR操作，劳动强度和试验室污染的可能性还是无法降低。

三明治式免疫-PCR是由传统ELISA方式的改编而来，即检测抗体连有DNA标记，再运用到分析检测生物样品。早期的抗体免疫-PCR检测形式是将初级抗体固定在平板上，然后依次加入样品，再用生物素化检测抗体，链亲和素和生物素化的DNA；后来改进为直接连接DNA到抗体上和用标记引物产生PCR产物，而PCR的扩增能力可产生大量DNA标记，这种DNA标记可用典型的凝胶电泳检测分析。PCR扩增抗体携带的DNA标记可提高对抗原检测的灵敏度(该法缺少用基因芯片法来检测)，比传统ELISA方法的灵敏度还高，但用凝胶电泳纯化扩增产物需要大量人工操作，因此耗时；而且用于PCR扩增的引物在退火时可引起二聚体扩增产生副产品；同时它还存在污染核糖或污染也将同样被扩增的情况。

免疫PCR方法是采用一个捕捉抗体，类似于直接ELISA三明治夹心法，不同点在于选择检测方法。该方法已被成功用于检测肿瘤坏死因子、β-半乳糖甘酶、人甲状腺刺激激素、鼠可溶T-细胞受体、重组乙肝表面抗原、不同的人心钠素、β-葡糖苷激酶、绒毛膜促性腺激素等物质，有的敏感度达10^-15摩尔水平。