[发明专利]一种抗GP73蛋白的单克隆抗体、其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体地说，本发明提供了一种针对高尔基蛋白GP73的单克隆抗体、其制备方法和应用。本发明还提供了一种用于检测人外周血样本中的高尔基蛋白GP73的免疫学定量检测试剂盒及其制备方法。利用该试剂盒可以快速、准确地计算人体外周血中的高尔基蛋白GP73的表达含量。

背景技术

肝细胞癌HCC(hepatocellular carcinoma)主要的病因学是HBV或HCV慢性肝病毒感染，在肝癌发生前一般有长时间的潜伏期——即感染肝病毒至肝癌发生时间。据2006年1月26日《中国医药报》报道以及《癌症》2005年第六期中文章的介绍，我国现有乙肝病毒携带者1.2亿左右，约占世界乙肝病毒携带者的1/3；有症状的慢性乙肝患者2000万人，另外我国还有肝硬化患者360万人。由于众多的肝病患者和肝癌高危人群，我国的肝细胞癌发病率最高。根据世界卫生组织国际癌症研究机构(IARC)估计，2000年全世界肝癌发病人数为56.4万，死亡54.9万人；我国肝癌发病人数30.6万，死亡30.0万人，约占全世界的50％。

在高危人群中建立早期诊断和监测机制是非常重要的。早期发现、早期治疗是提高患者生存率的关键，而大多数患者就诊时已届中晚期，失去了最佳治疗时机，高危险因素包括由乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒导致的慢性肝炎和肝硬化。另外要得到有效治疗，筛查和普查的临床效率依赖于早期诊断。

目前，HCC疾病传统上的监测是体检，肝超声影象分析和血清标志物系列检测。

其中最常使用的血清学标志物是甲胎蛋白AFP，由于甲胎蛋白AFP具有与HCC的相对特异性，因此目前得到广泛应用，但是部分良性肝病中AFP为阳性(特异性≤75％)和部分肝癌中AFP为阴性(灵敏度≤70％)，使得依靠AFP进行HCC预警和监测具有一定的局限性，而且AFP检测对于HCV相关 的HCC灵敏度不高。因此在临床上希望获得比甲胎蛋白特异性和灵敏度更高的新血清学指标，或者能够与AFP进行互补的指标。

近年来，蛋白组学技术的发展使得高通量筛选新的肿瘤标志物成为可能，各种有前景的新肿瘤标志物被相继发现，其中高尔基体蛋白73(GolgiProtein 73，GP73)最有可能成为更好的肝癌诊断尤其是早期肝癌诊断的血清标志物.

GP73(Golgi Protein 73)是一种II型高尔基跨膜蛋白，也是一种新发现的与肝病病程相关的蛋白。GP73的分子量接近73KD(Kladney et al.，2000，Gene 249，53-65)。GP73在病毒性感染的肝细胞中高表达(Kladney，et al.，2000，Gene 249，53-65)，在胆汁上皮细胞中也有表达，而在正常肝细胞中表达量很少。相反的，肝病患者的肝细胞显示对GP73抗体的强免疫反应。GP73 mRNA和蛋白在转染各种病毒(包括腺病毒)后的HepG2肝恶性肿瘤细胞中也有高表达。在患有病毒性肝病或非病毒性促成肝病如酒精性肝病，自身免疫性肝病等的患者中，GP73的表达量显著升高(Kladney，et al.，2002，Hepatology 35(6)：1431-40)。

2005年美国国家癌症研究所(National Cancer Institute，NCI)资助的一个课题组论证了GP73作为肝癌早期诊断指标的应用。对于早期肝癌的检测，GP73的灵敏度比AFP高出2-3倍，被认为是未来最有希望的一个肝癌预警新指标。对352例肝病患者的研究显示，GP73对HCC诊断的灵敏度为69％，特异性为75％。而其对早期肝癌诊断的灵敏度为62％，显著高于AFP(25％)。AFP低于20ng/ml的HCC患者中，有超过一半(57％)的患者GP73升高，提示GP73对HCC早期诊断，尤其是AFP阴性的早期HCC的诊断具有显著的优越性。

但是该研究采用的是蛋白印迹方法，免疫印迹方法为半定量分析，劳动量太大，不适于大样本量验证研究所需的高通量分析。此外，该方法采用的是多抗检测方法，而且该方法未建立定量标准。

本发明的目的正是为了解决目前临床上缺乏GP73定量检测试剂盒作为肝癌早期诊断检测手段的不足，提供了一种高活性的抗GP73单克隆抗体以及操作简便、准确灵敏的检测试剂盒和测定方法，以便从蛋白水平上观察GP73表达含量，能尽早采取有效的综合治疗方案，预防肝硬化和肝癌的发生。

发明内容

为了解决上述技术问题，在本发明的第一方面，提供了一种高活性的抗GP73单克隆抗体。