[发明专利]一种应用悬浮芯片技术检测宋内志贺氏菌方法

权利要求书

1.一种用于宋内志贺氏菌检测的悬浮芯片，包括诊断微球和与此诊断微球耦联的寡聚核苷酸探针，其特征是该寡聚核苷酸探针是宋内志贺氏菌O-抗原聚合酶基因rfc上的一段序列。

2.根据权利要求1所述用于宋内志贺氏菌检测的悬浮芯片，其中寡聚核苷酸探针如序列表中序列3所示，在其5′进行NH₂-(CH₂)₁₂修饰。

3.根据权利要求1或2所述用于宋内志贺氏菌检测的悬浮芯片，其特征是该芯片可鉴定和检测宋内志贺氏菌。

4.根据权利要求1或2所述用于宋内志贺氏菌检测的悬浮芯片，其特征在于包括一对特异性引物，引物序列如序列表中序列1和2所示，并对序列1进行5′Biotin修饰。

5.权利要求1或2所述用于宋内志贺氏菌检测的悬浮芯片的制备方法，包括如下步骤：制备寡聚核苷酸探针；用纯水稀释氨基修饰的探针；将储备的微球振荡，然后转移到棕色EP管中；离心收集微球，加入MES液进行振荡；向悬浮微球中加入上述探针，并振荡；在微球溶液中加入新配制的EDC溶液，振荡；然后进行温育；再次向微球溶液中加入新配置的10mg/ml EDC，振荡，然后进行温育；向微球溶液中加0.02％ Tween-20，离心收集微球；用0.1％ SDS重悬微球，离心收集微球；用TE悬浮微球；用血球计数板计算微球的个数，2—8℃，避光保存。

6.权利要求1或2所述用于宋内志贺氏菌检测的悬浮芯片使用方法，包括以下步骤：

a)根据宋内志贺氏菌rfc基因设计并合成用于PCR扩增的特异性引物，并对其中一条引物进行Biotin修饰；

b)按常规方法制备的待检样本基因组DNA，并使用步骤a)中的引物对待检样本基因组DNA进行PCR扩增，同时使PCR产物带上Biotin修饰；

c)将步骤b)中的PCR产物与权利要求1中所述悬浮芯片杂交；

d)对步骤c)中杂交悬浮芯片进行链霉亲和素化藻红蛋白标记，并对其检测荧光信号。

7.根据权利要求6所述的一种检测宋内志贺氏菌的方法，其特征是上述步骤b)所建立的PCR反应体系如下：

表格1 PCR反应体系

PCR反应程序为：37℃温育5min；94℃变性3min；运行35个循环：94℃ 30sec，53℃ 30sec，72℃ 40sec；最后，72℃延伸3min。

8.根据权利要求4所述的一种检测宋内志贺氏菌的方法，其中杂交温度为52℃，杂交时间为大于15min。