[发明专利]通过添加铜离子来使植物转化效率提高的方法

说明书

本发明是申请日为2004年8月12日的申请号为200480023227.2的中国发明专利申请“通过添加铜离子来使植物转化效率提高的方法”的分案申请。

技术领域

本发明是关于通过土壤杆菌属细菌来高效地进行将基因导入到植物材料中的方法。

背景技术

根据土壤杆菌法的基因导入，是利用土壤杆菌机能的植物转化方法。土壤细菌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)具有下列机能：感染植物时，使作为与土壤杆菌病原性相关的Ti(tumor-inducing)质粒的一部分的T-DNA重组到植物基因组中。根据土壤杆菌法的植物转化方法是下述方法：制备将Ti质粒的T-DNA结构域置换为希望向植物染色体组中导入的基因的转化用质粒，使用制备成具有该转化用质粒代替了Ti质粒的土壤杆菌，通过利用土壤杆菌的上述机能，将希望向该植物染色体组中导入的基因导入到植物染色体组中的方法。

由于认为土壤杆菌仅以双子叶植物为宿主，并不寄生在单子叶植物中，当初，根据土壤杆菌法的植物转化法主要是作为双子叶植物转化法来发展的。之后，进行了关于根据土壤杆菌法向单子叶植物进行基因导入的各种各样的尝试，开发了具有强病原性土壤杆菌一部分病原性基因的超级双元载体(super binary vector)，据报告，在使用该超级双元载体的方法中，在水稻、玉米等单子叶植物中也稳定，可以效率比较高的进行转化(例如参考：特许第2,649,287号公报；特许第3,329,819号公报；Hiei，Y.，等，(1994)，ThePlant Journal，Vol.6，p.271-282；以及Ishida，Y.，等，(1996)，Nature Biotechnology，Vol.4，p.745-750)。而且，报道了根据土壤杆菌法也在小麦、大麦以及高梁这样的单子叶植物中转化的成功例子(例如参考：Cheng，M.，等，(1997)，PlantPhysiol.，Vol.115，p.971-980；Tingay，S.，等，(1997)，Plant J.，Vol.11，p.1369-1376；以及Zhao，Z-Y.，等，(2000)，Plant Mol.Biol.，Vol.44，p.789-798)，达到了在单子叶植物中也可广泛进行根据土壤杆菌法的转化。

根据土壤杆菌法的转化法，一般的具有：效率高，被导入的基因复制数少，不用将叫做T-DNA的特定结构域片断化就可导入，因为通过短期培养就可获得转化体所以培养变异少等很多优异的特征。因此，现在它作为在不论双子叶还是单子叶的很多种类的植物中最有用的转化手段而广泛应用。

根据土壤杆菌法的转化方法，根据植物种类，受试材料、培养的培养基的组成不同，但共同点是：不管是哪种植物，都是使组织材料与土壤杆菌悬浊液接触，在共存培养后，进行转化细胞的筛选，制备出转化植物。一般地，形成材料的植物组织，视需要进行灭菌处理，但除此之外没有特别的处理，进行土壤杆菌的感染(例如参考：Rogers，S，G.，等，(1988)，Method for PlantMolecular Biology，p.423-436，CA:Academic Press Inc.；Visser，R.G.F.，(1991)，Plant Tissue Culture Manual，B5:1-9，Kluwer Academic Publishers；McCormick，S.，(1991)，Plant Tissue Culture Manual，B6:1-9，Kluwer Academic Publishers；以及Lindsey，K.，等(1991)，Plant Tissue Culture Manual，B7:1-13，KluwerAcademic Publishers)。

根据土壤杆菌法的转化在很多种类的植物中都有报道，但也存在其转化效率随植物的种类、基因型以及形成材料的组织而有很大不同(例如参考：Potrykus，I.，等，(1998)，Agricultural Biotechnology，NY：Mercel Dekker Inc.，p.119-159)的问题。在培育导入实用基因的品种时，制备出很多的转化植物是必要的，通过一年而高效率地稳定地获得转化植物的技术开发是重要的。还有，不依赖植物的种类或基因型的转化法，在高效率地培育实用品种方面是极为有用的。而且，不依赖于形成材料的植物组织的转化法的开发，也在高效率地促进转化方面是必要的。