[发明专利]圆斑星鲽性别特异分子标记及遗传性别鉴定方法

说明书

技术领域：

本发明属于水产生物技术领域中的鱼类遗传性别鉴定和性别控制技术，是一种能在鱼类单性育种中应用的鱼类遗传性别鉴定的分子生物学方法。

背景技术：

我国有着丰富的鱼类资源，其中许多鱼类在生长速率上存在着性别差异，例如，罗非鱼雄性比雌性生长快约40％以上，而圆斑星鲽等海水鱼类，雌性个体比雄性个体生长快40％-100％，因此，开展这些鱼类遗传性别检测和性别控制的研究既有重要的科学意义，又有重大的应用潜力和推广前景。

圆斑星鲽(Verasper variegates)是我国特有的一种名贵经济海水鱼类，属于近海冷水性鱼类，我国北方沿海均有分布，以黄海、渤海为多。圆斑星鲽由于其味道鲜美，肉质细嫩，营养丰富，深受广大消费者欢迎，其市场价值极高，养殖前景非常广阔。尽管近2年来，圆斑星鲽人工育苗技术获得突破，年产圆斑星鲽苗种近百万尾，但是，研究表明圆斑星鲽雌性个体和雄性个体在生长速率上存在很大差别，其雌性个体比雄性个体大80-100％。由于雄性个体生长过慢，降低了圆斑星鲽的养殖产量，增加了养殖成本，因而严重影响了圆斑星鲽苗种的推广及养殖产业的形成，由于难以鉴定圆斑星鲽的遗传性别，严重影响了圆斑星鲽雌核发育和性别控制研究的进行。

有关鱼类性别相关分子标记的研究，目前只是在少数几种鱼类上进行过。采用的主要方法包括RAPD、SSR和AFLP等。加拿大西温哥华实验室的Devlin(1994)找到了大鳞大马哈鱼Y染色体特异的DNA片段；匈牙利农业生物技术中心的Kovacs等(2000)用RAPD扫描非洲鲶鱼雌雄基因池，找到两个雄性性别相关的RAPD标记，一个(CgaY1)大约2.6kb，另一个(CgaY2)458bp，这是首次从鲶鱼中找到性别特异的DNA标记。美国新罕布什尔大学的Lee等(2004)用分离集团分析法寻找罗非鱼表型性别相连锁的DNA标记，找到10个与罗非鱼表型性别连锁的微卫星标记。这些标记可以直接用于不同Y染色体等位基因功能的研究和具有一个或者几个Y染色体拷贝的亲鱼的鉴定。英国Stirling大学的Ezaz等(2004)用AFLP技术扫描尼罗罗非鱼基因组，找到三个Y染色体连锁(OniY425、OniY382、OniY227)和一个X染色体连锁(OniX420)的AFLP标记。而有关圆斑星鲽性别特异分子标记以及遗传性别鉴定的分子生物学技术，目前国内外均未见报道。

发明内容：

本发明的目的是为了筛选出圆斑星鲽性别特异分子标记，建立遗传性别鉴定的分子生物学方法，为圆斑星鲽性别控制和全雌育种研究提供分子标记和技术方法。

本发明其技术内容如下：一、圆斑星鲽性别特异分子标记筛选及其序列；二、圆斑星鲽遗传性别鉴定方法。

一、圆斑星鲽性别特异分子标记筛选及其序列，包括：1.圆斑星鲽性别特异分子标记筛选方法；2.圆斑星鲽性别特异分子标记的序列。

1.圆斑星鲽性别特异分子标记筛选方法；包括：1)、圆斑星鲽鳍条DNA的提取；2)、基因组DNA的AFLP分析；3)、性别特异分子标记的筛选：

1)、圆斑星鲽鳍条DNA的提取：

剪取重约10mg鳍条置于600μl裂解液中匀浆，加蛋白酶K和RNaseA，于55℃水浴消化至澄清。加入600μl的酚:氯仿:异戊醇混合物(25:24:1)抽提，充分混匀后离心(12000rpm，10min)；吸取上清液再次抽提、离心；最后，用1000μl的冰乙醇沉淀DNA，经70％乙醇洗涤和自然干燥后，用TE溶解，将DNA保存在-20℃备用。

所述的裂解液组成为10mM Tris-HCl，pH8.0；100mM EDTA，pH8.0；100mM NaCl；0.5％SDS；

所述的蛋白酶K终浓度为18-22mg/ml；

所述的RNaseA终浓度为95-105μg/ml；

所述的基因组DNA的浓度应不低于20ng/μl，基因组DNA的纯度要求OD₂₆₀/OD₂₈₀值为1.76-1.80。

2)、基因组DNA的AFLP分析：

基因组DNA的AFLP分析主要包括如下步骤：第一步对DNA模板进行酶切，第二步是将特异接头连接到酶切片段上，第三步是进行预扩增，第四步是进行选择性扩增，第五步是电泳分析。

所述的对DNA模板进行酶切，其方法是：先用EcoRI/MseI酶混合物(1.25U/μl)消化80-110ng模板DNA6小时，用1％琼脂糖凝胶电泳检测酶切是否充分，将充分酶切的DNA溶液置于70℃孵育15分钟灭活限制性内切酶。