[发明专利]用于多型人乳头瘤病毒检测的多肽及其用途

说明书

技术领域

本发明属于诊断学范畴，涉及免疫诊断学、实验诊断学、肿瘤诊断学基础3个技术领域，同时还涉及生物医药工程技术领域。具体地，本发明涉及用于多型人乳头瘤病毒(HPV)感染的检测及HPV L1的纯化，所述的多肽衍生自HPV主要外壳蛋白1(HPV L1)。

背景技术

1933年人类首次发现乳头瘤病毒，1978年，第一例生殖道HPV被鉴定[1]。目前，根据HPV DNA序列表达基因不同，已确定的HPV亚型超过200种，其中，85种HPV的基因克隆被鉴定，另有120种的部分基因型被鉴定，并且，有30余种是从生殖道组织中分离得到[2]。根据HPV感染的部位，分为皮肤型和粘膜型；根据其致病性的大小，分为高危型和低危型。高危型主要有HPV16、18、33、31、58和52等，与宫颈癌的发病有关；低危型主要有HPV6、11、42和44等，与生殖道疣状物有关。

目前，随着宫颈癌病因学的研究进展，其防治方法也在不断地提高和发展。在HPV疫苗尚未在人群中应用之前，普查仍是预防和控制宫颈癌的主要手段。大量研究表明HPV持续感染是引起宫颈上皮癌变的主要危险因素，尤其是高危型HPV。随着检测技术的提高，宫颈癌组织中HPV的检出率高达99％，其中，HPV 16占55％至60％，HPV 18占10％至12％，HPV 31和HPV 45分别占有4％至5％[3]。因此许多学者提出把检测HPV作为宫颈癌的筛查手段。目前，HPV的检测主要有病理学变化、免疫组化、分子生物学技术和血清学检测等方法。

1.HPV感染宫颈的病理学改变

细胞病理学改变：在宫颈移行区取材，行巴氏染色，可见由HPV引起的挖空细胞，即可诊断。此方法简单易行，无痛苦，经济实用，可用于大规模普查和筛查。但其敏感性低，假阴性率高。近年来，已由传统的巴氏涂片发展成薄层巴氏涂片和涂片自动检测系统。此方法应用新的收集和制作过程，大大降低了结果的假阴性率。主要有以下：PAPNET系统、Auto Pap3000Qc、Thinprep2000和CYTORICH等。

组织病理学改变：对宫颈无明显癌变的可疑区取材做病理检查，当发现挖空细胞，就可诊断有HPV的感染，并可发现宫颈细胞是否有异型性，是宫颈癌及其癌前病变确诊的依据。

2.免疫组化检测HPV感染

取少量病变组织制成涂片，用特异抗人类乳头瘤病毒的抗体作染色。如病损中有病毒抗原，则抗原抗体结合。常用过氧化物酶抗过氧化物酶方法(即PAP)，此方法有较好的特异性，还能显示出病毒感染的部位，操作简单，有一定的诊断价值，但是检测率低，敏感性不高，且不能分型。另外，有学者在不典型鳞状细胞(ASCUS)患者的宫颈涂片和活检组织中加入抗P16抗体和克隆E6H4后进行免疫组化染色，发现巴氏涂片为ASCUS并且活检为鳞状上皮内瘤样变(SILs)的患者P16表达的强弱与HR HPV的病毒量密切相关，P16免疫染色检测HR HPV病毒量的灵敏度、特异度、阳性预测值(PPV)和阴性预测值(NPV)分别为95％、96％、91％、98％[4]。P16的过度表达是HR HPV致病活跃的指示器。此法可作为宫颈癌普查中检测宫颈上皮细胞是否感染高危型HPV的可靠简单的方法。

3.分子生物学技术

3.1样本

分子生物学技术检测的样本通常是宫颈部的上皮组织，可以是用于细胞学检查的宫颈刮片或宫颈细胞拭子，这些生殖道脱落细胞为检材避免了活检取材、研磨组织繁杂操作。但如果样本量不够，会影响结果的灵敏度，故大多数还是通过阴道镜下宫颈活检来获得样本。也有学者提出，宫颈癌患者的血液也可用来检测HPV DNA。但是，Patti Key通过实验指出：宫颈癌患者晚期，HPVDNA才释放到血液，即使被检测到，也无诊断学意义，它只对判定有无宫颈癌血液转移具有一定的参考价值[5]。最近，B.K.Prusty等提出，宫颈外周的上皮及阴道正常的脱落细胞进入尿液，当有HPV感染时，这些脱落细胞中也会含有病毒基因或毒粒。收集尿液可直接用于PCR检测HPV DNA，他们对55名已婚妇女的尿液、宫颈刮片、活检组织分别进行PCR检查，结果发现三者中检测到的HPV阳性符合率接近100％[6]。用尿液作为检测生殖性HPV的感染是一种有用简单无创伤性的方法，可进一步证实并被采用。

3.2检测指标

目前，检测的指标主要有以下三种：

(1)HPV DNA检测：是最常用的检测指标，作为宫颈癌的初筛手段可更灵敏地检出宫颈癌及其癌前病变，其方法简单，客观性强。但是不能区分是持续性感染还是重新感染。