[发明专利]大肠埃希氏菌K88、K99、987P纤毛抗原的提取方法

说明书

技术领域

本发明涉及致病性大肠埃希氏菌的三种K88、K99、987P纤毛抗原的提取方法，属于生物技术，特别是兽用生物制品领域。

背景技术

仔猪黄痢是由特定O抗原型的致病性大肠埃希氏菌(E.coli)引起的初生仔猪的以下痢为特征的传染病。该病主要导致1周龄内(主要是1～3日龄)仔猪发病，以排出黄色水样粪便和渐进性死亡为特征，是影响规模化种猪场和农村散养猪仔猪成活率的重要疾病(Salajka E，et al..Colonization factor different from K88，K99，F41，and 987P inenterotoxigenic Escherichia coli strainsisolated from postweaning diarrhoea in pigs.VetMicrobiol，1992，32(2)：163；逄媛，等.仔猪腹泻性大肠杆菌基因工程疫苗的研究进展.上海畜牧兽医通讯，2007，(5)：2-3)。

致仔猪黄痢的致病性大肠埃希氏菌的致病力主要由粘附素性纤毛和肠毒素两类毒力因子构成，二者密切相关且缺一不可。己发现猪大肠埃希氏菌的的纤毛主要有F4(K88)、F5(K99)、F6(987P)以及比例较小的F41。纤毛是一种蛋白质，具有良好的免疫原性，以含单价或多价纤毛抗原的灭活全菌疫苗或亚单位疫苗对妊娠母猪进行免疫，可使仔猪从初乳中获得抗仔猪黄痢的被动保护力(袁万哲等.仔猪大肠杆菌病K88-K99-987P-F41四价亚单位疫苗的研制V.疫苗生产与免疫效力试验.中国兽医学报，2007，27(6)：818-821；Gill P，Purchid V D.Identification of K88 fimbriae of E.coli associated with pigletdiarrhea.Indian Journal of Comparative Microbiology Immunologyand Infective Diseases，1999，20(2)：126-128；JinL Z，et al..Inhibition of enterotoxingenic Escherichia coli K88，K99 and987p by the Lactobacillus isolates from porcine intestine.Journal of the Science of Food and Agriculture，2000，80(5)：619-624)。

提取大肠埃希氏菌纤毛抗原的常用方法有两种，即加热法和切割法(房海.大肠埃希氏菌.河北科学技术出版社，1997年，359-365)。其中加热法的原理是将大肠埃希氏菌悬液加热至一定温度后(一般为60～65℃)，使菌毛与菌体分离；而分割法的原理是用匀浆搅拌器处理大肠埃希氏菌悬液，在高速匀浆搅拌的机械切割作用下，使菌毛与菌体分离。本发明综合加热法和切割法的特点，在将菌悬液加热的同时利用高速机械切割的方法提取纤毛抗原，不但提高了工作效率，提升了提取液中纤毛抗原含量，而且适合于规模化处理大批样品。

发明内容

本发明的目的是提供一种简便、高效的可应用于规模化提取大肠埃希氏菌K88、K99、987P纤毛抗原的新工艺，为工业化生产仔猪黄痢纤毛亚单位疫苗奠定了坚实的基础。

本发明的内容为：一种提取大肠埃希氏菌K88、K99、987P纤毛抗原的新工艺：采用剪切机(T25型，德国IKA公司生产)在58～65℃对含不同纤毛抗原的大肠埃希氏菌的菌悬液按5000～6000r/min的剪切强度剪切20～25min分别进行各纤毛抗原的提取。

具体实施方式

下面结合附图对进行具体说明：

1生产用种子制备

(1)生产用菌种  表达K88纤毛抗原的大肠埃希氏菌菌种为C83549，生长K99纤毛抗原的大肠埃希氏菌菌种为C83644，生长987P纤毛抗原的大肠埃希氏菌菌种为C83710。