[发明专利]防止无血清微载体细胞聚集的培养物及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种细胞培养物，尤其是一种能够有效防止无血清微载体细胞培养过程 中，微载体易通过细胞连接出现聚集的培养物，属于生物制品技术领域。

背景技术

培养哺乳动物细胞对生产生物制品如：疫苗、酶、激素、抗体是十分重要的。大多 数动物细胞是贴壁依赖性细胞，需要贴壁后才能生长和增殖。传统的培养贴壁依赖性细 胞是在培养皿或转瓶中进行的。随着病毒疫苗及基因工程蛋白等生物制品需求量的增 加，发展新的系统并更大规模的培养细胞已成为一种必然。自从1967年Van Wezel发 明微载体以来，用微载体培养细胞的技术不断取得进步，每毫升可培养出上亿个细胞。

微载体培养细胞相比其他大规模培养细胞方法具有很多优点：1.微载体可提供较大 的比表面积，通过改变微载体的使用浓度来提高单位体积培养细胞的数量，以此来获得 细胞基质产品的高产量。2.细胞增殖与传代可以只在一个高产容器内进行，而不是多个 低产容器，以充分利用培养基，达到节约培养基的目的。3.容易操作及控制多个细胞培 养条件，如：pH、PO2、pCO2等。4.取样操作简单易行。5.因为微载体颗粒容易沉降， 所以收获细胞和下游产品的纯化操作容易进行。6.微载体培养细胞可选择不同的规模， 容易放大培养规模。

用微载体大规模培养细胞虽有如此多的优点，但仍存在下列问题：1.在无血清条件 下，微载体颗粒聚集成团现象较为严重，甚至影响了细胞的贴壁和生长；2.在低血清 条件下，细胞在微载体上的贴壁及生长状况并不理想；3.在无血清条件下，市场上可供 选用的微载体数目有限，而且价格大都比较昂贵。

在哺乳动物细胞培养中，培养基(液)是维持体外细胞生存和生长的基本溶液，是 组织细胞培养时最重要的条件。随着细胞培养技术发展和应用范围的扩大，对各种培养 液的要求也越来越严格。现在大多数人工和合成培养基需要加入不同浓度的血清才能培 养细胞。血清除了提供细胞生长的营养条件外，还能促进细胞DNA的合成，并含有细胞 增殖所必需的生长因子。但由于血清成分非常复杂，对一些要求较高的基础性研究的结 果影响较大。同时血清中也含有一定的细胞毒性物质和抑制性物质，对细胞有去分化作 用，影响细胞某些功能的表达。尤其是血清中可能带有外源因子，如疯牛病病毒等。在 以细胞为基质生产疫苗的过程中，血清中的某些成分会严重影响病毒感染细胞的效果， 如流感病毒、甲肝病毒等。因而，很多培养研究工作者都在研制、寻求不含血清的无血 清或无蛋白的培养液。目前已商品化的无血清培养液有Sigma公司的MCDB131，它可用 于培养内皮细胞，还有Biofluids公司的LHC-9，主要用于培养器官上皮细胞等。

无血清和无蛋白微载体培养细胞则综合了微载体培养细胞和无血清培养细胞两者 的优点，表现出极大优势，但实际操作过程中仍存在下列问题：①无血清条件下接种细 胞后，微载体易通过细胞连接出现聚集成团的现象，一旦聚集成团将影响细胞在微载体 上的均匀贴壁。②接种细胞时，一部分贴壁于微载体上的细胞不能及时伸展而凋亡。③ 在无血清条件下，微载体的聚集成团会严重影响细胞的贴壁和生长。如；在用无血清微 载体培养Vero细胞时，Cytodex 1、Cytodex 2等都会不同程度的聚集成团。

在微载体培养过程中，为改善细胞的贴壁性能以及促进细胞的生长，可采用下列途 径；用胶原或明胶来包覆微载体，如Cytodex 3，但价格昂贵，而且细胞贴壁也不理想， 还会产生弱的载体聚集。

用胶原包覆微载体后能显著改善细胞的贴壁和生长，而且细胞容易从微载体上用酶 消化下来。目前几种胶原包覆的微载体已商品化，如：SoloHillm胶原包被微载体和法 玛西亚的Cytodex 3。专利“胶原包覆载体的制备工艺”(US 4,994,388)，应用胶原 包裹核心球粒(微载体半成品)经过了两个步骤：包裹和固定，即核心球粒先悬浮在酸 性胶原溶液(0.01-0.1N醋酸)中，再使溶液蒸发干燥。干燥的、胶原包裹的核心球粒 再悬浮在含蛋白交联剂(如戊二醛)的溶液中，使得胶原交联固定。在此专利中应用的 是胶原或变性胶原，它是三条α-肽链组成的三螺旋结构，且不溶于水，只有在酸性 环境中才能溶解。