[发明专利]一种检测中药材抗流感病毒活性的方法

说明书

技术领域：

本发明涉及对中药材生物活性检测方法技术领域，具体涉及一种检测中药材中抗流感病毒生物活性的方法。

背景技术：

流感病病毒神经氨酸酶(NA)是影响流感病毒复制、感染和致病的关键酶，NA抑制药可以通过抑制NA活性而有效地控制流感症状和疾病的传播，NA活性可以通过检测荧光的变化被表征，NA活性荧光检测法已发展为抗流感病毒药物的筛选和活性评价的重要方法，但其多用于西药、植物药的单体成分的抗流感病毒活性检测和评价，该方法尚无用于在中药材的抗病毒活性筛选和评价中的报道。

当前，板蓝根等清热解毒类中药抗流感病毒活性检测和评价常采用整体动物试验、病毒感染细胞试验、红细胞凝集试验等，采用的观测手段和方法则主要是肉眼观测、光学显微镜观察、物理称重、常规生化指标检测等，结果表现形式以状态描述、定性、半定量为主，因此无法达到测量结果精密度高、重复性好以及样品在检测时性质稳定的要求。

且由于原NA活性检测方法主要用于化学单体的活性检测，背景干扰较小，酶活性对照组以及背景对照组并未加入被测样品，而对检测结果的准确性影响较小，但由于板蓝根等中药化学成分复杂，背景干扰大，无法直接将原NA活性检测方法直接应用于板蓝根、黄芩、金银花、连翘等清热解毒类中药以及它们所含活性成分的抗流感病毒活性检测。

发明内容：

化合物MUNANA(4-methylumbelliferyl-N-acetyl-α-D-neuraminic acid)是NA的特异性底物，在NA作用下的产物4-甲基-7羟基香豆素(4M，7-Hydroxy-4-methylcoumarin，C10H803)在355nm入射波长激发下，可以产生460nm荧光，采用荧光检测器测定该波长荧光强度(Fluorescence Intensity)的变化，可以灵敏地反应NA活性；同样，如果反应体系中加入能够抑制NA活性的药物，则随着荧光产物4MU生成的减少，所检测到的荧光强度会相应减弱，从而该药物的NA抑制活性就能通过荧光强度的变化被表征。

针对传统方法中对板蓝根等清热解毒类中药抗流感病毒活性检测和评价方法的缺点以及原NA活性检测方法无法直接应用于中药材以及中药中特定成分的检测的缺点，本发明结合某些中药具有抑制NA活性的作用，化合物MUNANA是NA的特异性底物，MUNANA与NA的反应产物具可发出荧光的特点提出了一种新的检测方法。

本发明公开了一种新检测中药材抗流感病毒活性的方法。

本发明的技术方案如下：

一种检测中药材抗流感病毒活性的方法，它包括以下步骤：

a、NA原酶液的制备：用含1g·L^-1牛血清白蛋白和5mg·L^-1胰酶的细胞维持液将流感病毒稀释10倍后加入到MDCK单层细胞的细胞培养瓶中，于37℃、5％ CO₂条件下培养2天后，于-70℃冻存，反复冻融2次后在4℃、800g·min^-1条件下离心10min，取上清液，加入0.1％(W/V)NP_-40，分装置-70℃保存备用；

b、中药材样品的制备：将中药材粉碎后，加8-10倍量的溶媒进行提取后过滤，取滤液，回收溶媒获得提取物，将所得提取物溶解后微孔滤头除菌，备用；

c、设置样品测试组：将上述步骤a和b中获得的物质以1:1的比例进行混合后，室温下作用30min后加入相同体积的MUNANA，37℃下孵育60min后加入终止液终止反应；

d、设置背景对照组：将步骤b中获得的中药材样品与MUNANA以2:1进行混合后用buffer补足至相同体积；

e、设置酶活性对照组：将步骤c中获得的NA原酶液与MUNANA以2:1进行混合后，待反应结束后加入与原酶液同样体积的样品溶液；

f、将步骤c、d、e获得的反应液用荧光酶标检测仪进行检测后，按下式获得抑制率I；

g、对步骤b中中药材样品的剂量和步骤f中抑制率I的数据用量反应平行线测定法进行处理，获得中药材样品的生物效价。

上述的方法，其中在所述步骤a之后还包括用MUNANAN对NA原酶液中NA活性的标定步骤。

上述的方法，其中所述步骤b中的中药材样品的原料为板蓝根、黄芩、金银花或连翘等中的一种。

上述的方法，其中所述步骤b中的溶媒为水、乙醇、甲醇、乙酸乙酯或缓冲液中的一种。