[发明专利]亚细胞区域靶向性、长波长、双波长比率法Ca2+荧光探针及合成方法

权利要求书

1、亚细胞区域靶向性、长波长、双波长比率法Ca²⁺荧光探针，其特征在于这类探针具有以下结构通式：

式中：R₁，R₂，R₃，R₄＝氢原子，烷基直链或支链，烷氧基直链或支链，磺酸基，酯基；R₁，R₂，R₃，R₄可以相同或不同；R₅＝烷基直链或支链，末端含羟基或氨基或磺酸基的烷基直链或支链；Y＝C(CH₃)₂，O，S。

2、亚细胞区域靶向性、长波长、双波长比率Ca²⁺荧光探针的合成方法，其特征在于具体步骤如下：

第一步、室温下将分析纯的N，N-二甲基甲酰胺与1，2-双(2-氨基苯氧基)乙烷-N，N，N’，N’-四乙酸乙酯混合，搅拌至溶解，然后冷却到-2℃，向其中滴加三氯氧磷，然后室温搅拌20～50h；反应结束后，在搅拌下将该反应混合物倾入是其质量3～15倍的0℃去离子水中，即有沉淀析出，用浓度为1％～8％KOH溶液调节该悬浮液至中性，抽滤，将所得粗产品重新溶解于是其质量25～50倍的乙酸乙酯中，并用乙酸乙酯体积的1/3～1倍的去离子水和饱和NaCl溶液分别洗2次；将有机相干燥，过滤，旋转蒸发仪减压蒸发至无液体滴出得棕色油状物，柱层析分离得纯产物5，5’-二醛基-BAPTA-四乙酯；

第二步、将第一步制得的5，5’-二醛基-BAPTA-四乙酯悬浮于0.5～2mol·L^-1NaOH水溶液中，加热回流40～100min得清亮淡黄色溶液即5，5’-醛基-BAPTA的钠盐；将所得5，5’-醛基-BAPTA的钠盐溶液冷却至0℃，搅拌下滴加浓HCl酸化至pH＝1～2，伴随沉淀析出，将析出沉淀抽滤，用10～100mL冷水洗涤滤饼3次，立即室温真空干燥，得淡黄色粉未状化合物5，5’-二醛基-BAPTA；

第三步、将含活性甲基底物与有机溶剂混合，搅拌至溶解；然后在搅拌下向其中加入第二步制得的5，5’-二醛基-BAPTA和分析纯的三乙胺；上述混合物在氮气保护，在温度25℃～120℃下反应0.5h～24h，用旋转蒸发仪旋转蒸发至无液体滴出，冷却后析出固体，所得固体用纯净水溶解，然后降温至-5～-15℃，用浓盐酸酸化析出沉淀，过滤得目标产物。

3、如权利要求2所述的亚细胞区域靶向性、长波长、双波长比率Ca²⁺荧光探针的合成方法，其特征在于：第一步中三氯氧磷与1，2-双(2-氨基苯氧基)乙烷-N，N，N’，N’-四乙酸乙酯的摩尔比为3～8∶1，N，N-二甲基甲酰胺与三氯氧磷的体积比是5～20∶1。

4、如权利要求2所述的亚细胞区域靶向性、长波长、双波长比率Ca²⁺荧光探针的合成方法，其特征在于：第二步中NaOH与5，5’-醛基-BAPTA-四乙酯的摩尔比为6～40∶1。

5、如权利要求2所述的亚细胞区域靶向性、长波长、双波长比率Ca²⁺荧光探针的合成方法，其特征在于：第三步中含活性甲基底物的结构特征是2-甲基苯并吲哚的鎓盐、2-甲基苯并噁唑的鎓盐和2-甲基苯并噻唑的鎓盐中的任意一种；所使用的有机溶剂是无水甲醇、乙醇、正丁醇、乙二醇或甲醚中的任意一种或任意比例混合。

6、如权利要求2所述的亚细胞区域靶向性、长波长、双波长比率Ca²⁺荧光探针的合成方法，其特征在于：第三步中含活性甲基底物与5，5’-醛基-BAPTA的摩尔比为2～6∶1，有机溶剂的用量使得含活性甲基底物的浓度在10～150mmol/L，三乙胺与有机溶剂的体积比为1∶10～1∶50。