[发明专利]一种具有凝血活性的蛋白类物质

说明书

技术领域

本发明涉及一种具有凝血活性的蛋白类物质及其制备方法，尤其涉及一种 具有凝血活性的蛋白类物质以及从蛇毒中提取该物质的方法。

背景技术

蛇毒中含有多种蛋白和多肽，它们大多为特殊蛋白酶和活性多肽。这些物 质可能作为支持物质参与消化，并且也是蛇毒出血毒和神经毒的主要原因。1767 年，Fontana首次叙述了蛇毒的凝血作用，此后的二百多年来，有关蛇毒应用于 血液系统的研究不断取得成绩。自20世纪70年代以来，许多蛇毒类药物，如 Ancrod、Batroxobin、Crotalase及Reptilase已发展成临床药物，它们在血液 和心血管疾病的治疗中扮演着重要角色。世界卫生组织将从矛头蝮蛇(Borher atrox)蛇毒中分离纯化的凝血酶样酶命名为：“Batroxobin”，它具有多种临床 用途，如用于止血被称为“Retilase”；用于分解纤维蛋白原、抑制血栓形成称 为“Defibrase”；用作诊断试剂的称为“Reptilase—Reagent”。其中知名度 较高的立芷雪(Reptilase)是瑞士素高制药厂制造的，从蝮蛇中提取的用于治 疗和预防出血症状的药物。其中含有两种成分：巴曲酶以及微量的凝血因子X 脂依赖性激活剂(FXA)，由于其具有速效，高效，安全方便且不受血浆凝血酶 抑制剂影响等诸多优点，广泛用于治疗和预防各种出血性疾病。其中的巴曲酶 为类凝血酶，经鉴定其为单链糖蛋白，可由数种蛇毒中分离获得，随着蛇种不 同，其性质存在一定差异，研究的较为清楚的是矛头蝮蛇巴曲酶，相对分子量 43kDa，等电点为6—7，是单链糖蛋白。立芷雪中的凝血因子X脂依赖性激活剂 (FXA)亦可从数种蝮蛇中提取得到，对于其分子量和等电点的报道不尽相同， 有报道美洲矛头蝮FXA为分子量83kDa，等电点4.9的酸性蛋白；也有报道圆斑 蝰蛇蛇毒的FXA分子量为104kDa等等，就目前报道的FXA性质来看，多数FXA 蛋白具有分子量较大的共性，这可能是由于其在体内发挥特定功能而对结构的 要求。

1957年Ouyang从尖吻蝮蛇蛇毒中分离获得了凝血酶样酶并对其性质进行 了比较深入的研究，将该酶定名为Acutin。国内学者对蝮蛇的凝血活性物质也 进行了研究，并取得一系列进展。云南昆明动物所将从尖吻蝮蛇中提取的Acutin 称为“去纤酶”，用于临床治疗脑血栓、心脏血栓、眼底静脉血栓及脉管炎，疗 效显著。由于蛇毒中含有多种具有体外凝血活性的蛋白以及多肽物质，分离纯 化困难，目前国内的蛇毒止血类产品只有辽宁锦州奥鸿药业以东北长白山白眉 蝮蛇蛇毒为原料生产的邦亭(注射用白眉蛇毒血凝酶)一种产品上市销售，该 产品中的蛇毒凝血酶的SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳含有54kDa，34kDa以及15kDa 三条带，目前对此三条电泳条带的凝血酶样酶的药理作用未见详尽报道。尖吻 蝮蛇在我国的分布地区有安徽(南部)、重庆、江西、浙江、福建(北部)、湖 南、湖北、广西(北部)、贵州、广东(北部)及台湾省等，分布范围广，国内 多家机构对尖吻蝮蛇蛇毒中的凝血活性组份进行研究，取得了一定的成果，但 目前为止，尚未有尖吻蝮蛇蛇毒凝血药品成功上市。本发明人经过长期试验研 究，发现一种新的具有凝血活性的蛋白类物质，并基于此完成本发明。

发明内容

本发明提供一种具有凝血活性的物质A，其特征在于：它是单链蛋白类物质， 其还原性SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳在31±2kDa呈单一条带；MALDI-TOF方法 测定其分子量为30500±1000Da；等电点为4.4-4.8；采用面积归一化法测定纯 度98％以上；Edman降解法测定的N末端15个氨基酸序列如下： VIGGNECDTNEHRFL。其在体外对人纤维蛋白原具有较强的凝结活性，比活性为 500—1500U/mg。

本发明提供的具有凝血活性的物质A可以从蛇毒中提取得到，也可以在测 定物质A的全序列之后，采用生化领域常用的基因工程的方法获得。优选从蛇 毒中提取获得。

本发明还提供了一种从蛇毒中提取所述具有凝血活性的物质A的方法，包 括以下步骤：

(1)称取蛇毒，以pH7.0的Tris—HCl缓冲液溶解后，低温高速离心去除 悬浮物，取上清液，得所述具有凝血活性的物质A粗品；

(2)上述粗品经过阴离子交换柱层析、超滤及凝胶排阻层析等多次纯化后 得到所述具有凝血活性的物质A纯品。

所述方法具体包括如下步骤：