[发明专利]离体快速繁殖地乌的方法

说明书

技术领域

本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种离体快速繁殖地乌的方法。 

技术背景 

地乌，其学名是林荫银莲花(Anemone Flaccida Fr.Schmidt)为多年生草本，属于毛茛科银莲花属植物，其干燥根茎称为地乌，俗称地乌。每年3～5月为地乌地上部生长发育时期。基生叶1—2片，长叶柄，五角形，长2～7cm，宽3～10cm。根状茎近圆柱形，最大直径为1cm，3～5年方能采收入药。地乌野生资源主要分布于长江中下游各省海拔1500～3000m的山坡林下阴湿处，鄂西山地分布相对集中。由此看来，野生地乌分布面积有限，生长期短，生长缓慢，生物量小，属于珍稀植物。 

地乌性味温、辛、微苦，由地乌提取物制成的银莲花胶囊具有祛风湿、强筋骨、消肿止痛之功效，地乌对类风湿性关节炎有良好的治疗作用，而且毒副作用很小。由于野生地乌珍稀，对地乌进行中成药开发，不能仅仅依靠野生资源，必须规模化人工栽培，否则，将导致地乌野生资源枯竭，自然生态环境遭到破坏。 

通过检验，地乌种子活力很低，目前，在实验室条件下很难用其种子直接发芽生产地乌种苗。因此，现阶段地乌规模化人工栽培的种苗只嫩那个通过地乌的离体繁殖(组织培养)来获取，关于地乌的离体快速繁殖目前国内外文献中尚未见报导。 

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提出一种离体快速繁殖地乌的方法，以缩短常规育苗时间，提高育苗效率，实现地乌的快速繁殖。 

本发明通过以下技术方案实现： 

一种离体繁殖地乌的方法，包括以下步骤： 

(1)外植体的选择与消毒： 

1)选择地乌根茎带老组织的长度为1-2cm的休眠芽和刚萌发未展开的叶片作外植体； 

2)将该外植体用如下方法进行消毒： 

a.外植体为休眠芽的消毒：先在自来水下将地乌根茎芽体表面的泥沙冲洗干净，并用软毛刷将乌根茎芽体表面的老死组织刷洗干净，至芽体呈现白色，用1.5％的多菌灵水溶液浸泡2h，在用自来水冲洗0.5h，转移至超净工作台，用75％酒精消毒30-60s，无菌水冲洗1-2遍，再用0.2％升汞溶液消毒8-12min，无菌水冲洗4-5遍，使该外植体在每次无菌水中的冲洗时间至少保持为1min，备用； 

b.外植体为刚萌发未展开的叶片的消毒：将刚萌发未展开的叶片用自来水冲洗干净，转移至超净工作台上，用75％酒精消毒30s，0.2％升汞消毒5min，无菌水冲洗2-3遍，备用； 

(2)接种与培养：用无菌滤纸吸去所述外植体表面水分，将所述叶片切成1cm×1cm小块；或将休眠芽表面的老组织切除，然后从该芽中间剖开；将所述的休眠芽或叶片的外植体接种到不定芽或拟球茎诱诱导培养基上，诱导产生不定芽或拟球茎；或者将所述的芽或刚萌发未展开的叶片外植体接种到胚性愈伤组织诱导培养基上，使其诱导产生胚性愈伤组织；外植体培养条件为：每天光照12h，培养温度17-20℃，光照强度3000Lux，得到地乌不定芽或拟球茎或胚性愈伤组织； 

(3)继代、增殖与分化培养：将步骤(2)得到的拟球茎或不定芽转移到不定芽或拟球茎增殖培养基上进行增殖培养；或将步骤(2)得到的胚性愈伤组织转移到胚性愈伤组织增殖培养基上进行增殖培养，进而再转移到分化培养基上培养，得到丛生芽；继代、增殖和分化的条件：每天光照12h，培养温度17-20℃，光照强度为3000Lux； 

(4)生根培养：将步骤(3)的拟球茎或不定芽或丛生芽转移到生根培养基上培养40-50d，使其生根；培养条件为：5℃，暗培养； 

所述培养基成分如下： 

不定芽或拟球茎诱导培养基：MS基本培养基+2.0mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA，头孢噻肟钠300mg/L，0.8％～1％琼脂，3％蔗糖，补充蒸馏水至1L，调pH至5.8-6.0； 

胚性愈伤组织诱导培养基：MS基本培养基+2.0mg/L 6-BA+1.0mg/L NAA，头孢噻肟钠300mg/L，0.8％～1％琼脂，3％蔗糖，补充蒸馏水至1L，调pH至5.8-6.0； 

不定芽或拟球茎增殖培养基：MS基本培养基+2.0mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA，头孢噻肟钠300mg/L，0.8％～1％琼脂，3％蔗糖，补充蒸馏水至1L，调PH至5.8-6.0；