[发明专利]一株产促真菌凋亡脂肽的解淀粉芽胞杆菌及由该菌制备的脂肽与应用

说明书

技术领域

本发明属于农业微生物学技术领域，具体涉及一株产促真菌凋亡脂肽的解淀粉芽胞杆菌的分离筛选及活性物质的制备。本发明还涉及部分生物化学与分子生物学技术领域。

背景技术

许多芽胞杆菌，例如枯草芽胞杆菌(Bacilus subtilis)，蕈状芽胞杆菌(B.mycoides)和解淀粉芽胞杆菌(B.amyloliquefaciens)，都可以抑制许多植物病原真菌和人类病原真菌的生长。许多这类抗真菌物质都被鉴定出具有环状脂肽表面活性剂的特征。这些脂肽能抑制很多真菌的生长，包括曲霉属(Aspergillus)，镰孢菌属(Fusarium)，丝核菌属(Rhizoctonia)和一些酵母(假丝酵母属)等。还有一些脂肽的抗肿瘤活性也得到了关注。现在有许多研究者对芽孢杆菌产生的脂肽产生了浓厚的兴趣，关注的内容主要包括它很高的表面活性和潜在的疗效方面的特性。

芽胞杆菌产生的环状脂肽主要包括一个脂肪酸链连接的多肽形成一个环，所以脂肽是一个生物学上的表面活性剂，它包括一个亲脂和一个亲水基团。基于脂肽是一个高生物表面活性剂，被认为它能通过与细胞膜的相互作用而使其破裂。还有人认为它们能在双层膜中形成选择性离子通道，包括在磷脂双分子层中形成选择性离子通道。

有关脂肽的作用机理如上所述，基于其表面活性剂的作用导致细胞质膜的穿孔而起杀菌作用。然而，我们在对由一株解淀粉芽胞杆菌产生的脂肽作用机理进行研究的时候发现，诱导真菌细胞凋亡也是其抑菌的重要机理之一。凋亡，又称细胞程序性死亡，首先在动物中发现。最近的研究成果表明，真菌(包括酵母和丝状真菌)在某些条件下(如衰老、UV、某些化学物质)也可诱导凋亡的发生，从而表现为典型的凋亡现象，如核浓缩，DNA的断裂，细胞质膜磷脂酰丝氨酸的外翻，活性氧的产生，凋亡小泡的形成等等一些动物中出现的凋亡特征。在动物细胞中，凋亡通常有2条途径，一条是通过胞外信号激活细胞内的凋亡酶caspase，另一条是通过线粒体释放凋亡酶激活因子激活caspase。这些活化的caspase可将细胞内的重要蛋白降解，引起细胞凋亡。我们的实验结果表明，在解淀粉芽胞杆菌脂肽作用后，表现为核断裂，核浓缩、细胞质膜磷脂酰丝氨酸外翻、活性氧等细胞凋亡特征。脂肽诱导的细胞凋亡可能在解淀粉芽胞杆菌对真菌的拮抗作用中起重要的作用，因为在自然生态中芽胞杆菌产生的脂肽可能并不足以导致细胞膜的穿孔，但却可诱导凋亡的发生，这也部分解释了一定浓度的脂肽表现为抑菌作用而非完全杀死真菌。

许多芽胞杆菌产生的生物活性剂物质能用于植物病害的生物控制，从而减少化学药物的使用来保护环境。抗真菌，肿瘤和病毒也使芽胞杆菌作为寻找新抗生素的生物资源。但是现在仅有很少的抗真菌物质被分离鉴定，而且现在被鉴定的芽胞杆菌产抗菌物质多为枯草芽胞杆菌所产脂肽。我们分离到的解淀粉芽胞杆菌产生的脂肽为分子量较大的脂肽，不同于以往报道的小分子量脂肽，该脂肽对水稻纹枯病菌、玉米小斑病菌、棉花枯萎病菌、小麦赤霉病、棉铃炭疽病菌、杨树溃疡病菌、灰霉菌等多种植物病原真菌具有显著的拮抗效果。我们以丝状真菌水稻纹枯病菌以及酵母菌中的假丝酵母为代表进行研究，发现该脂肽促真菌细胞凋亡的作用是其拮抗作用的重要表现。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，通过分离、筛选获得一株产促真菌凋亡脂肽的解淀粉芽胞杆菌，分析该菌株是否具有能对植物真菌病原菌具有有很好拮抗作用的活性物质，申请人从水稻根系分离得到了这株目的细菌。试验表明分离的这株细菌属于一株解淀粉芽胞杆菌，它能产生促真菌凋亡的一种脂肽，可作为细胞凋亡研究的诱导物，也可作为抗植物病原菌的有效成分。本发明提供了分离筛选该解淀粉芽胞杆菌的方法，对其产生的活性物质进行了表征分析，并对该活性物质的应用前景进行了试验，从而完成本发明。

实现本发明的技术如下所述：

申请人通过分离筛选获得一株分离的对植物真菌病原菌具有很好拮抗作用活性物质的微生物菌株CH1，经16SrRNA分析和其他形态学等分析，确定该菌株为解淀粉芽胞杆菌(Bacillus.amyloliquefaciens)，申请人将其命名为解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)CH1。该菌株已于2008年9月5日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCC NO：M208127。