[发明专利]一种检测口蹄疫病毒基因组RNA的单细胞实时荧光定量RT-PCR的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测口蹄疫病毒基因组RNA的单细胞实时荧光定量RT-PCR的方法，适用于在单细胞水平上研究口蹄疫病毒的复制，进而分析病毒的急性感染与持续性感染的机理，探究在感染过程中病毒与宿主细胞的关系。

背景技术

口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus：FMDV)属小RNA病毒科口蹄疫病毒属，其所在的RNA病毒科在医学和兽医学上具有重要地位，该病毒主要引发偶蹄动物发生口蹄疫。基因组由一条正义的RNA链组成，约含8500个核苷酸，其复制经由一条互补的负链RNA作为模板。病毒感染其敏感细胞系(如仓鼠肾细胞系BHK-21或猪肾细胞系IB-RS-2)，宿主细胞会发生致细胞病变效应(CPE)，表现为细胞变圆，内细胞膜重排等。除急性感染外，口蹄疫病毒还能在动物和细胞中建立持续性感染。

基于口蹄疫病毒基因组的特点，现已建立了许多相关的检测方法包括杂交实验(Verheyden，B，Lauwers，S，et al.Quantitative RT-PCR ELISA to determine theamount and ratio of positive-and negative-strand viral RNA synthesis and the effectof guanidine in poliovirus infected cells.J.Pharm.Biomed.Anal[J]，2003，33：303-308.)、常规RT-PCR(Hofmann，MA，Thür，B，et al.Rescue of infectiousclassical swine fever and foot-and-mouth disease virus by RNA transfection and virusdetection by RT-PCR after extended storage of samples in Trizol[J].J.Virol.Methods，2000，87：29-39.)以及近年建立的实时荧光定量RT-PCR(King，DP，Ferris，NP，et al.Detection of foot-and-mouth disease virus：comparative diagnostic sensitivity of twoindependent real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays[J].J.Vet.Diagn.Invest.，2006，18：93-97；Horsington，J，Zhang，Z.Analysis of foot-and-mouthdisease virus replication using strand-specific quantitative RT-PCR[J].J.Virol.Methods，2007，144：149-155.)。与其他的检测方法相比，荧光定量RT-PCR技术优势明显，如灵敏度高、速度快、特异性强，可减少交叉污染等。然而所有的这些检测方法都是基于群体细胞的检测(组织块或细胞系)，所获得是群体细胞中病毒复制的数据，只能反映群体细胞中的病毒量而不能获悉单个细胞中病毒的感染及其复制情况。