[发明专利]显性抑制突变体F427D作为炭疽芽孢杆菌毒素抑制剂及疫苗的应用

说明书

技术领域

本发明涉及动物细菌学与人畜共患传染病学技术领域。具体涉及一种显性抑制突变体F427D作为炭疽 芽孢杆菌毒素抑制剂及疫苗的应用。

背景技术

炭疽(anthrax)是由炭疽芽孢杆菌引起的人畜共患的一种急性、热性、败血性传染病。以突然 高热和死亡、可视黏膜发绀和天然孔流出煤焦油样血液为特征。OIE将其列为B类疫病和国家法定报告 疾病。炭疽杆菌是需氧芽孢杆菌属中的一种长而粗的大杆菌，无鞭毛不能运动，革兰氏染色阳性。有 繁殖体和芽孢两种形式，在有充足的氧气和适当的温度下能形成具强大抵抗力的炭疽芽孢。由于炭疽 易于生产和制备，其孢子状态可以长期稳定存在，对恶劣的环境有极强的抵抗力而且炭疽芽孢的吸入 致死量很低，长期以来炭疽芽孢杆菌都被用作首选的生化武器。

强毒炭疽杆菌主要致病因子包括：细菌荚膜和炭疽毒素。炭疽荚膜能保护炭疽杆菌逃避巨噬细胞 的吞噬(Guidi-Rontani等″The alveolar macrophage：the Trojan horse of Bacillus anthracis.″ Trends Microbiol 10(9)：405-9)。炭疽毒素蛋白包括三种成分：保护性抗原(protective antigen， 简称：PA)、致死因子(lethal factor，简称：LF)和水肿因子(edema factor，简称：EF)。炭疽毒 素是A-B型毒素，它的B部分：PA是炭疽毒素的运输结构，它能挑选细胞与易感细胞上的PA受体结合，转运 炭疽毒素的A部分：LF或EF到细胞质中杀死细胞。PA是一个83kDa的蛋白含有有弗林蛋白酶(furin)的切 割位点，细胞受体结合位点和LF及EF的结合转运位点；PA与易感细胞受体结合后被细胞上的蛋白酶切割去 掉N端20kDa的片段，留下63kDa的PA(PA63)结合在细胞受体上，PA63在细胞表面聚合成为内孔封闭的 七聚体(PA63)7。LF或EF与七聚体上的接合位点结合形成复合物后被细胞吞噬形成吞噬小体进入细胞质。 细胞质内的酸性环境促使七聚体封闭的内孔打开，LF或EF就通过这个内孔被转运到细胞质中。

将PA基因的第397赖氨酸突变为天冬氨酸(K397D)，第425位天冬氨酸突变为赖氨酸(D425K)，第427 位苯丙氨酸突变为丙氨酸(F427A)或删除PA蛋白的结构域二后，这些PA突变体(MPA)不但活性丢失而且 将其与野生型PA(简称：WPA)混合时能抑制其活性，这种突变体的抑制活性称为显性抑制活性(Dominat Negative，DN)，这些突变体PA称为显性抑制突变体(DNPA)(Sellman等，″Dominant-negative mutants of a toxin subunit：an approach to therapy of anthrax.″Science 292(5517)：695-7)(Ahuja等， ″Deletion mutants of protective antigen that inhibit anthrax toxin both in vitro and in vivo.″ Biochem Biophys Res Commun 307(3)：446-50)。DNPA能与WPA聚合形成杂合的PA七聚体，阻止WPA对底 物EF和LF的转运，使得转运到细胞内的EF和LF大大减少，抑制炭疽毒素对细胞的毒性。其中PA基因中的第 427位氨基酸在PA七聚体中间微孔的打开和LF/EF的转运中发挥着关键的作用。野生型PA中第427位氨基酸 是苯丙氨酸，PA聚合形成七聚体后苯丙氨酸被聚合在微孔中间，七个苯丙氨酸的七个苯环在微孔内形成φ 嵌的结构。φ嵌的作用就像伴侣分子，当PA底物LF或EF通过微孔时它能抓住底物上的疏水位点促使底物从 七聚体微孔中转运(Krantz等，″A phenylalanine clamp catalyzes protein translocation through the anthrax toxin pore.″Science 309(5735)：777-81)。将PA第427位的苯丙氨酸突变为11种其它的氨基酸 时，这些427的突变体有的不能正常的转运底物，有的影响PA七聚体内孔的打开，但这些突变体都具有显 性抑制活性(Sun等，″Phenylalanine-427 of anthrax protective antigen functions in both pore formation and protein translocation.″Proc Natl Acad Sci U S A 105(11)：4346-51)。