[发明专利]HBV YMDD突变、前C区突变/BCP区突变和基因分型一体化检测DNA微阵列芯片

说明书

技术领域

本发明涉及一种DNA微阵列芯片，特别是涉及HBV YMDD突变、前C区/BCP区突变和基因分型一体化检测DNA微阵列基因芯片。本发明采用固相载体基片，针对HBVYMDD突变、前C区/BCP区突变位点和HBV基因型设计寡核苷酸探针，制备成DNA微阵列芯片，可以一次性同时检测三项指标，并可以同时检测多个样本，将广泛应用于临床HBV感染治疗过程中的个体化用药指导。

背景技术

乙型肝炎是由乙肝病毒(HBV)引起的、以肝脏炎性病变为主并可引起多器官损害的一种传染病。世界上有20亿人感染过HBV，目前慢性HBV感染患者至少有3.8亿，其中慢性HBV携带者75％分布在东南亚和次撒哈拉地区，而我国就占了1.5亿，其中有2000万人为慢性乙肝患者，每年死亡的人已近50万。随着分子生物学的应用和发展，HBV DNA定性定量检测已常规应用于临床，以决定用药选择和疗效监测。但乙肝病毒具有高复制率(10^12-13病毒粒/天)高突变率(10^10-11点突变/天)特点，高突变是由于基因组复制，需先转录为RNA中间体，但聚合酶缺乏校正功能所致。乙肝病毒这种高突变性造成乙肝病毒在治疗中产生种种困难。HBV基因组多态性和编码区基因突变是影响乙肝诊断、治疗和预后判断的重要因素，目前已受到临床上高度重视。对HBV基因组多态性研究主要集中在三个方面：HBV基因分型、HBV YMDD突变相关点突变、HBV前C区/BCP区突变。

拉米夫定(Lamivudine，LAM)是当前乙肝病毒治疗广泛应用的核苷类似物，它能显著降低乙肝病毒DNA水平，并可使ALT正常化和肝组织改善。其作用机理是抑制乙肝病毒的逆转录和复制。但在LAM长期治疗中，乙肝病毒会发生变异，产生耐药，其机理是LAM作用位点(YMDD)发生突变。迅速及时地检测乙肝病毒的YMDD突变，特别是能检测少量YMDD突变，可以帮助医生及时改变用药，防止拉米夫定出现严重的耐药性，减少由YMDD突变株引起的症状恶化。在乙肝患者接受治疗前检测聚合酶区基因突变可以决定治疗方案，如果发生变异，则不宜用拉米夫定治疗，治疗后每三个月检测一次变异情况，如果变异，则要调整用药，可以考虑联合或更换阿德福韦继续治疗。

乙型肝炎病毒(HBV)感染血清标志物5项检测(乙型肝炎两对半检测)是HBV免疫学检测的金标准，以往观念认为HBeAg是HBV复制的标志，抗-HBe转为阳性被认为疾病基本进入稳定阶段。然而，研究表明，不少血清HBeAg阴性而抗-HBe阳性患者含有较高水平的HBV-DNA，在部分HBeAg阴性患者中，前C区/BCP区A1896(nt1896G→A)变异、密码28终止变异，导致产生HBeAg合成和分泌的障碍，但是HBV仍在复制，A1899(nt1899G→A)变异常和A1896相伴出现，提示病毒有较高的复制水平和传染性。HBVC基因启动子(BCP)T1762、A1764(nt1762A→T、nt1764G→A)联合突变，可使HBeAg表达降低，和前C区/BCP区A1896变异协同影响血清学转换。此外，这些突变和干扰素的疗效及机体免疫应答关系密切，研究发现，T1762、A1764双变异与活动性肝脏炎症和肝功能损害程度相关，基因突变加剧了肝脏的纤维化和癌变的进程，可作为预后的评价指标。

乙肝病毒由于基因组变异和进化，可以分为不同的基因型。根据HBV全基因核苷酸序列异源性8％或S基因区核苷酸序列异源性4.2％，HBV基因型可分为A、B、C、D、E、F、G、H 8个型。HBV基因型的分布有明显的地域特征，欧美以A、D型为主，我国以及东南亚国家则以B、C型为主。研究发现，C型HBV感染者肝脏受损较严重，而B型感染者中年以前容易发展成肝细胞肝癌；C型HBV在肝硬化患者中的比例要比年龄相当的无症状携带者高得多，而且C型感染者发展至晚期肝病者显著多于B型感染者；C型HBV在年长人群中的感染率比较低，而B型在各年龄组的患病率相对恒定；另外，观察到B型病毒感染和50岁以下患者较早发生肝癌显著相关，C型病毒感染则和50岁以上患者肝癌的发病显著相关。不同基因型对治疗药物的反应也存在差异。α-干扰素对A型的治疗效果比D/E型好。B型和C型相比，C型干扰素治疗效果差，含C型的患者血清中ALT值高，比B型更易发生核心启动子序列突变，并且对α-干扰素治疗敏感性降低，而B型对α-干扰素有更好的应答。HBV基因型有明确的地域性分布的特征，且与临床表现、肝损害程度、病毒感染的状态、预后(如慢性、肝硬化和癌变倾向)存在密切相关性，基因型分析将会对乙肝的诊断、治疗和预后判断发挥积极的作用。