[发明专利]HCV基因分型DNA微阵列芯片

说明书

技术领域

本发明涉及一种DNA微阵列芯片，特别是涉及丙型肝炎病毒(HCV)基因分型DNA微阵列芯片。本发明采用固相载体基片，针对HCV不同基因型设计寡核苷酸探针，制备成DNA微阵列芯片，用于快速准确对血液样品中丙型肝炎病毒进行分型检测。

背景技术

丙型肝炎是严重危害人类健康、流行范围广泛的传染病，其病原体为丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)。目前，全球有超过1.7亿人感染HCV，其中每年有超过10万例HCV患者发展为肝癌，进而出现消化道出血及腹水。根据WHO 2002年年报，在2001年，慢性肝病引起1,400万例死亡，包括79.6万例由肝硬化引起、61.6万例由原发性肝癌引起。

HCV是正性单链RNA黄病毒，包括9,400左右个核苷酸。HCV基因组具有一个单独的开放阅读框，基因结构由5’-NCR-C-E1-E2-NS1-NS2-NS3-NS4-NS5-N-CR-3’组成，编码一具有3,010个氨基酸的多聚蛋白体，翻译后被分为病毒复制和病毒粒形成所必须的结构和非结构蛋白。HCV具有高度的变异性(其变异率高达1.4-1.9×10^-3/核苷酸/年)和本身具有负选择作用的特征，高突变是由于复制酶无校正功能；易误性RDRP(error-prone RDRP，EP-RDRP)的存在以及正选择作用等原因。而其本身具有负选择作用又表现为：病毒基因组中各种基因结构及功能不同，有些区域高度保守。根据全世界不同地区分离的HCV不同株的全部或部分基因组的系统进化分析，目前HCV可以分成1～6型共六个型别，各型又分亚型，HCV亚型已经超过50个，其中最常见的是1a，1b，2a，2b，3a，6a，各型核酸序列之间相差31-34％，氨基酸序列相差大约30％，而亚型序列之间相差约20-23％。有几种HCV病毒株主要从东南亚被分离出，被命名为HCV 7，8，9，10，11型，除了HCV10a型(目前被列入HCV3型)，由于其系统进化上的相似性，其余各型被列入HCV 6型。

研究表明，HCV不同型别之间对干扰素治疗的敏感度不一，特别是1型较其它型别敏感度尤为差。不同型别HCV感染性肝炎，其急性、慢性的中度及重度、肝炎后肝硬化及原发性肝癌发生率都有不同，HCV基因型与丙型肝炎患者临床病情及其严重程度密切相关。

目前对HCV基因分型方法主要有：限制性长度多态性(RFLP)，型特异性引物PCR，型特异性探针核酸杂交分析，RDB，直接测序等方法，但是这些方法大多存在操作繁琐，检测时间长，通量低，还存在灵敏度低，特异性不高等缺点。本发明采用基因芯片技术，由于该技术可以将极其大量的HCV分型探针同时固定于支持物上，制备成HCV基因分型DNA微阵列芯片，所以本芯片可以一次性对多个样本中的HCV进行准确分型，从而解决了传统方法的不足。

发明内容

本发明所解决的技术问题是，克服现有技术的缺陷和不足，制造具有高通量、高准确性的DNA微阵列芯片，可以一次性对多个样本中HCV进行准确分型检测。

因此，本发明的目的是制备一种丙型肝炎病毒(HCV)基因分型DNA微阵列芯片，以满足大量血液样品进行HCV快速准确分型的需要。

为此，本发明采用以下技术方案：采用固相载体基片，针对HCV不同基因型设计的特异性寡核苷酸探针，制备成DNA微阵列芯片，再配以RT-PCR系统，使得每张芯片可以一次性同时检测多个样本的HCV基因型。

根据本发明一个优选的实施方案，针对HCV不同型别的基因序列，设计一套特异性寡核苷酸探针(见表1)，采用自动点样机器人，将探针印制在一张玻片的特定区域，每张玻片印制10个微阵列矩阵，这样就制成DNA微阵列芯片，一张芯片可以检测8份样本。

根据本发明另一个优选的实施方案，在上述的DNA微阵列芯片的基础上再配以其它必要的组份，如PCR引物(见表2)，即组成完整的产品。在实际检测时，取8份人基因组DNA溶液，采用CY3标记引物和不对称PCR方法，扩增出可能存在的HCV基因组CY3标记靶标片段。取DNA微阵列芯片一张，在8个杂交区分别加入8种PCR产物2ul和杂交液8ul，同时在阳性和阴性对照区加入参照产物溶液，将芯片放在自动杂交洗涤仪的杂交槽内，杂交温度50℃，杂交时间40分钟，自动洗涤吹干。取出玻片，放入GenePix 4100A扫描仪进行扫描，使用分析软件对扫描图像信号进行图像数据转换处理，并分析产生样本HCV型别结果。