[发明专利]铜绿假单胞菌基因快速诊断试剂盒及其检测方法

权利要求书

1.一种铜绿假单胞菌基因快速诊断试剂盒，其特征在于由Bst DNA聚合酶、反应液、稳定液、样品预处理液、显色液和阳性对照液组成，以上五种液体分别置于容器中，

反应液内两对引物为：

外引物F3：CGCGTACGGATACCTCTCC；

外引物B3：GCACCTTCACCGGAAGCA；

内引物FIP：CGTTGGCGACCGTCAGTTCAGGTTTTCCGCTCAGGGCGATGT；

内引物BIP：AATTCGGCAAATTTGCTGCGCTTTTTCTTGGAGGAGCAACCCACA；

每1L反应液中含有1.6～2mmol dNTP、20～25mmol Tris-HCl、10～12.5mmol氯化钾、10～12.5mmol硫酸铵、8～10mmol硫酸镁、1～1.25ml TritonX-100、0.8～1mol甜菜碱、内引物FIP/BIP各1.6～2mol和外引物F3/B3各0.2～0.25mol；

每1L样品预处理液中含有10～20mmol pH 8.0的Tris-HCl、1～2mmol EDTA和10～12ml Triton X-100；

上述阳性对照为铜绿假单胞菌基因组DNA。

2.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于所述的显色液为SYBR Green I或EvaGreen。

3.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于所述每1L样品预处理液中含有20mmol pH 8.0的Tris-HCl、2mmol EDTA和12ml Triton X-100。

4.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于所述每1L反应液中含有2mmol dNTP、25mmol Tris-HCl、12.5mmol氯化钾、12.5mmol硫酸铵、10mmol硫酸镁、1.25ml TritonX-100、1mol甜菜碱、内引物FIP/BIP各2mol和外引物F3/B3各0.25mol。

5.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于所述稳定液为石蜡油。

6.一种检测铜绿假单胞菌的方法，其特征是使用权利要求1所述试剂盒，按下列步骤进行：

(1)将待测样品经滤膜过滤，洗脱后，于离心管中离心，去上清，沉淀中加入样品预处理液并混合均匀，沸水浴灭活后冰上冷却，高速离心后，上清即为样品模板DNA；

(2)在反应管中加入反应液38～40体积％，Bst DNA聚合酶大片段0.9～1.8体积％，稳定液52～54.5体积％，样品模板DNA 4.5～9体积％，恒温反应；恒温反应的反应条件为温度63～65℃，反应时间45～90min；

(3)在上述反应管和阳性对照组中分别加入显色液，混匀，样品组显色与对照组相同则为阳性，否则为阴性。

7.根据权利要求6所述检测方法，其特征在于步骤(1)中，滤膜孔径为0.22μm～0.45μm。