[发明专利]转基因构建物及其在制备时空可调性肝脏损伤模型中的应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及转基因构建物及其在制备时空可调性 肝脏损伤模型中的应用。

背景技术

肝器官移植是目前临床治疗急性肝功能衰竭、终末期肝病以及代谢性肝病 的主要手段。然而由于供体肝的短缺，肝器官移植的临床应用受到了严重限制。 美国每年约有14000人等待肝移植，其中50％等待超过1年，每年约1300人 由于等不到肝移植而死亡。我国要求行器官移植的等待名单也不断增多。因此， 临床急需其他方法来改善肝功能，延长患者的生存时间来等待肝移植，或取代 肝移植。

肝细胞具有较强的增殖能力。1988年Bumgardner等率先提出了肝细胞移 植的概念，1993年由Mito等在世界上开展了第一例人体肝细胞移植技术，当 时实行的是自体同源性肝细胞移植。随后肝细胞移植技术迅速发展，并成为生 物医学研究的热点领域之一。通过实验动物的临床前期试验显示，肝细胞移植 在肝脏、脾脏和其他一些部位后，仍能维持其正常光镜和电镜结构，并且能表 达多种肝细胞功能，如血清白蛋白分泌、糖原储存和酵解、胆红素结合、氨代 谢以及细胞色素P450酶基因表达等。有望通过肝细胞移植治疗的疾病包括肝 脏本身的疾病和肝相关性疾病，如急、慢性肝功能衰竭、慢性病毒性肝炎和肝 硬化等。

我国首例肝细胞移植于2004年获得成功。目前肝细胞移植已经积累了丰 富的临床经验，并能部分或全部代替肝移植而应用于临床。但是，肝细胞移植 研究的核心仍然是肝细胞的来源问题。临床研究表明，自体成熟的肝细胞最适 合临床移植，但这本身就是一个矛盾，为此，人们急于寻求其它来源。

ES细胞向肝细胞的定向分化，体细胞重编程后向肝细胞的定向分化似乎成 为解决这一问题的有效手段。然而，定向分化产生的“肝细胞”功能是否正常， 需要有好的肝损伤模型来检测，该模型最好是时空可调节的，可随时地且高效 地诱导形成肝损伤。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可用于制备时空可调性肝脏损伤模型的转基 因构建物。

本发明的另一目的在于提供一种时空可调性肝脏损伤模型及其制备方法。

在本发明的第一方面，提供一种用于制备时空可调性肝脏损伤模型的构建 物组合，其包括：

(1)构建物1，从5’至3’依次包括以下可操作性相连的元件：

启动子，LoxP序列，报告基因序列，终止子1，LoxP序列，tBid基因序 列，Bax基因序列，终止子2；和

(2)构建物2，从5’至3’依次包括以下可操作性相连的元件：

启动子，突变型雌激素受体配体结合结构域基因序列，Cre重组酶基因序 列，和终止子；其中所述的突变型雌激素受体配体结合结构域可被雌激素类似 物激活进而激活Cre重组酶活性，不被动物体内雌激素激活。

在另一优选例中，所述的雌激素类似物选自：它莫西芬(Tamoxifen)，或 4-羟它莫西芬(4-OH Tamoxifen，4-OHT)。

在另一优选例中，所述的突变型雌激素受体配体结合结构域来源于小鼠雌 激素受体；较佳的是小鼠雌激素受体氨基酸序列(参见GenBank登录号： NM_007956)第281-599位，并且，其中第525位甘氨酸(G)突变为精氨酸(R)。

在另一优选例中，所述的突变型雌激素受体配体结合结构域来源于人雌 激素受体；较佳的是人的雌激素受体氨基酸序列(参见GenBank登录号： NM_000125)第282-594位，并且，其中第400位甘氨酸(G)突变为缬氨酸 (V)、第543位甲硫氨酸(M)突变为丙氨酸(A)、第544位亮氨酸(L)变为 丙氨酸(A)。

在另一优选例中，构建物1中，所述的报告基因是β-半乳糖苷酶基因。

在另一优选例中，所述的报告基因3’端还连接有抗性基因序列；较佳的， 所述的抗性基因是新霉素(Neomycin，Neo)抗性基因。

在另一优选例中，构建物1中，所述的启动子是CAG(巨细胞病毒增强子， 鸡β肌动蛋白和兔β球蛋白联合启动子)启动子；或构建物2中，所述的启动 子是白蛋白(Alb)启动子。

在另一优选例中，构建物1中，所述的终止子1是3×多聚A(3个PA串 联而成)，或所述的终止子2是兔β球蛋白多聚A。

在另一优选例中，构建物2中，所述的终止子是SV40多聚A。