[发明专利]用于真细菌多样性分析的针对16S rRNA基因的引物

说明书

技术领域

本发明涉及一对用于PCR的引物。特别涉及一对用于真细菌多样性分析的针对16SrRNA基因的引物。

背景技术

在过去的二十年中，微生物多样性研究的方法有了飞速的发展。这些手段主要依赖于聚合酶链式反应(PCR)对目的基因的扩增。16S rRNA基因是这类研究中使用最有效最普遍的分子标记。这些分子生物学方法的进展使我们能对未能培养的微生物进行一定的研究，有助于我们对来自各种环境中的未知微生物群落进行分类学和生态学层面上的研究。

微生物多样性的研究主要依赖于对16S rRNA基因这类研究中使用最有效最普遍的分子标记的分析。而这种分析通常需要使用PCR技术。引物是PCR的关键，直接影响到能否全面反映微生物多样性。

目前，尽管有多种真细菌的16S rRNA引物在研究中被用到，但缺乏适合于单方向测序可读取长度的的此类引物。

发明内容

本发明的目的在于提供一对用于真细菌多样性分析的针对16S rRNA基因的引物对，该引物对的碱基序列为：

f，：5’-GCCTAACACATGCAAGT-3’；

r：5’-ATGCTCCACCTCTTGT-3’。

本发明搜集了Shigella boydii，Bacillus anthracis，Clostridium acetobutylicum，Lactobacillus acidophilus，Mesoplasma florum，Acidobacteria bacterium，Escherichia coli的全长16S rRNA基因，运用MEGA 4.0软件进行序列排列，挖掘其保守区段的序列。随后运用引物设计软件Primer Premier 5.0进行引物设计。考虑到后续测序能力，每条序列单方向测序的有效读取长度一般小于1000个碱基，所以设计出扩增片段长度约900个碱基对的引物：f，(5’-GCCTAACACATGCAAGT-3’)；r，(5’-ATGCTCCACCTCTTGT-3’)

本发明提供的用于真细菌多样性分析的针对16S rRNA基因的引物具有很好的通用性和实用性，能良好反映实验对象中真细菌的多样性，可以适用于来源于土壤，沉积物，人畜胃肠道等环境样品的分析。

附图说明

图1是本发明实施例一中，PCR电泳图，S为PCR产物

图2本发明是实施例二中，根据所构建的16S rDNA克隆文库的测序结果所建立的

系统发育进化树的一个小分支。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规条件，如分子克隆(Molecular Cloning：A Laboratory Manual，3rd ed.)中所述条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例一：使用本发明引物进行对环境微生物基因组DNA样品的扩增

取来源于沼气池浆中微生物基因组DNA样品，进行PCR扩增。PCR的反应体系为50μl：10×buffer：5μl，10mM dNTP：1μl，10mM primer f：2.5μl，10mM primer r：2.5μl，Taq酶(2U/μl)：1μl，DNA：0.5μl，ddH2O：37.5μl。PCR参数设计如下：起始变性5分钟，95℃；30个循环(变性30秒，95℃；退火30秒，55℃；延伸50秒，72℃)；最后延伸7分钟，72℃。琼脂糖凝胶电泳所用琼脂糖浓度为1％的凝胶，含0.5μg/mL溴化乙锭，所用DNA分子量标记(Marker)为北京天为时代科技有限公司的100bp ladder。电泳结果见图1。