[发明专利]一种提高重组蛋白在克鲁维酵母中表达量的方法

权利要求书

1.一种提高重组蛋白在克鲁维酵母中表达量的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

(1)将菊粉酶基因的启动子、α-信号肽、目的蛋白和菊粉酶基因的终止子编码序列依次连接；

(2)将(1)得到的序列插入克鲁维酵母表达载体pUKD-S或者pUKD；

(3)用(2)获得的重组载体转化克鲁维酵母，发酵，取发酵上清液分离即可。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，(3)中采用的克鲁维酵母是乳酸克鲁维酵母、鹰嘴豆克鲁维酵母、马科斯克鲁维酵母或者脆壁克鲁维酵母。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所用的乳酸克鲁维酵母是MW179-1D HAP1基因缺陷菌株。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，(1)中启动子是通过以鹰嘴豆克鲁维酵母Y179的总DNA为模板，以P1和P2为引物，PCR扩增获得的；P1的序列如SEQ ID NO2所示，P2的序列如SEQ ID NO3所示。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，(1)中终止子是通过以鹰嘴豆克鲁维酵母Y179的总DNA为模板，以P5和P6为引物，PCR扩增获得的；P5的序列如SEQ ID NO6所示，P6的序列如SEQ ID NO7所示。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，(1)中的目的蛋白是酶、细胞因子、多肽、抗体或者疫苗抗原。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，(1)中的目的蛋白是菊粉酶。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，α-信号肽和菊粉酶编码序列通过以鹰嘴豆克鲁维酵母Y179的总DNA为模板，以P3和P4为引物，PCR扩增获得的；P3的序列如SEQ ID NO4所示，P4的序列如SEQ ID NO5所示。

9.一种用于提高重组蛋白在克鲁维酵母中表达量的载体，其特征在于，该载体由菊粉酶基因的启动子、α-信号肽、目的蛋白、菊粉酶基因的终止子编码序列和载体序列组成；其中，菊粉酶基因的启动子、α-信号肽、目的蛋白、菊粉酶基因的终止子编码序列依次连接；载体是pBS_SK、pUKD-S或者pUKD；菊粉酶基因的启动子、α-信号肽、目的蛋白、菊粉酶基因的终止子编码序列组成的DNA片段插入载体的多克隆位点。