[发明专利]一种天麻多糖硫酸化衍生物及其制备方法和抗肿瘤用途

说明书

技术领域

本发明涉一种从天麻中提取的天麻多糖的硫酸化衍生物及其制备 方法和用于制备抗肿瘤药物的用途。

背景技术

Id1是转录因子bHLH家族中DNA结合抑制蛋白中的一员，定位 于核内，是血管生成必须的促进因子之一。它在多数肿瘤中表达升高， 而在正常组织中的表达偏低，是一很好的抗肿瘤靶标。这使得针对Id1 开发低毒、高效、强特异性的抑制剂成为抗肿瘤药物研发的一个热点， 目前已报道一特异性靶向内皮细胞的反义核苷酸Id1-PCAO和一能抑 制侵袭性乳腺癌细胞中Id1表达的小分子大麻二醇(cannabidiol)。因为 反义核苷酸作为药物在技术上仍有诸多障碍，大麻二醇为大麻素类似 物，因而它们都不是很好的候选药物。

天麻(Gatrodia elata BL.)是一著名的传统中药，目前未见其中多糖 和多糖衍生物的正式报道。本发明人从天麻中分离得到天麻多糖，通 过硫酸化衍生得到的其硫酸化衍生物(WSS25)，WSS25能够在25μg/ml 剂量下几乎完全抑制Id1mRNA水平和蛋白质水平的表达，而抑制血 管生成，进而抑制肿瘤的生长，但是对内皮细胞几乎没有细胞毒性， 因而是低毒高效的Id1抑制剂。

发明内容

因此，本发明的一个目的在于提供一种从天麻中提取的天麻多糖 的硫酸化衍生物，其中该天麻多糖的结构式如下：

其中x和y为整数且x+y＝16，

n为整数，其峰尖分子量为2.8×10⁵，在其0.5mg/mL水溶液中的 比旋度为+95°；

该天麻多糖的硫酸化衍生物是天麻多糖主要在6位羟基上的硫酸化 衍生物，其峰尖分子量为6.5×10⁴，在其0.5mg/mL水溶液中的比旋度 为+150.0°。

本发明的另一目的为提供一种天麻多糖的硫酸化衍生物的制备方 法，该方法的具体步骤如下：

1)水提粗多糖(WGE)的制备：干燥的天麻饮片，经乙醇脱脂、干 燥后，用热水反复提取2～5次，合并提取液；所得提取液浓缩后用三 氯乙酸脱蛋白，离心分离，所得上清液经中和、透析、浓缩，得到一 浓缩液；加入2～5倍于浓缩液体积的乙醇，离心分离得沉淀，该沉淀 经真空干燥，得水提粗多糖WGE；

2)天麻多糖(WGESC1A)的制备：向上述步骤1)得到的水提粗多 糖WGE加入适量水溶解并离心，上清液用二乙基氨乙基纤维素[DEAE- 纤维素(Cl^-型)]为载体进行柱层析分离，分别以水、0.1～0.4mol/L NaCl 溶液剃度洗脱，其中0.1mol/L NaCl洗脱液经浓缩、透析以及冷冻干燥 得到白色絮状固体天麻多糖WGESC1A；

3)天麻多糖硫酸化衍生物(WSS25)的制备：经分子筛处理的吡啶 冰浴冷却后，将氯磺酸逐滴加入到吡啶中制成酯化试剂；经分子筛处 理的甲酰胺中溶解天麻多糖，该溶液冰浴冷却下，然后往该溶液中逐 滴加入上述制备的酯化试剂；反应完毕，反应液调pH值至7.8，然后 浓缩，所得浓缩液对饱和的NaHCO₃溶液透析后，换成对水透析；透 析袋内液冷冻干燥得天麻多糖的硫酸化衍生物WSS25。

更具体而言，在步骤1)中，取天麻干燥饮片，用95wt％乙醇脱脂 1周，脱脂后室温自然干燥；干燥后，用100℃水反复浸渍天麻饮片数 次，至提取液用硫酸-苯酚检测无明显反应，将每次的提取液合并后 加热浓缩；所得浓缩液冷却后以15％(W/V)三氯乙酸溶液脱蛋白，离心 分离，所得上清液用1mol/L NaOH中和至pH7.0，然后对流动水透析 72h，内液浓缩至小体积，在搅拌下加入三倍体积的95wt％乙醇，静 置过夜，倾去上清液，离心分离，所得沉淀依次用2倍体积的无水乙 醇、丙酮洗涤以脱去水分，离心分离，所得沉淀置40℃下真空干燥， 得水提粗多糖WGE。

在步骤2)中，取水提粗多糖WGE，用适量水溶解，离心除去不溶 物，上清液通过二乙基氨乙基纤维素[DEAE-纤维素(Cl^-型)]柱进行分 离。逐步以水、0.1mol/LNaCl、0.2mol/LNaCl和0.4mol/LNaCl洗脱， 用硫酸-苯酚法绘制洗脱曲线，根据洗脱曲线分别收取合并洗脱液， 其中0.1mol/L NaCl的洗脱液经浓缩，对蒸馏水透析，所得透析袋内液 冷冻干燥得天麻多糖WGESC1A。