[发明专利]一种新的基于腺病毒复制重组的肿瘤靶向基因治疗系统

说明书

技术领域

本发明与基因治疗领域相关，具体地讲，本发明涉及一套高效低毒的基因转移载体；其是具有特定结构的重组和/或经修饰的腺病毒载体。作为靶向目的细胞的基因转移的载体，并利用其在宿主细胞中的复制重组产生子代腺病毒，表达所携带外源基因，达到基因治疗，特别是各种癌症的基因治疗的目的。

背景技术

目前作为基因治疗的常见载体有逆转录病毒载体，腺病毒载体和腺相关病毒载体，其中作为肿瘤基因治疗较为常用的是腺病毒载体。

腺病毒是一种双链DNA病毒，其基因长度约为36kb，分为早期转录区和晚期转录区，目前的研究发现，人腺病毒有47个血清型，分属A-F6个亚属，其中C亚属的5型腺病毒是目前人们研究最为详细的一种。

将腺病毒删除E1区和E3区所得到的腺病毒载体常被称为第一代腺病毒载体，这种载体可以插入并表达长度约为8kb以内的外源基因，这种腺病毒载体本身不能复制产生子代病毒，腺病毒载体DNA也不整合进入宿主基因组中。

对于恶性肿瘤的基因治疗，要求病毒载体可以高效靶向地进入肿瘤细胞，表达治疗基因或靶向性地在肿瘤细胞内复制，进而杀死肿瘤细胞。腺病毒载体能感染多种肿瘤细胞，包括静止期细胞，腺病毒载体可以较为容易的大规模培养并获得高滴度的病毒纯品。这些特点使得腺病毒作为常用的肿瘤基因治疗载体。腺病毒作为肿瘤基因治疗的载体，提高其对肿瘤细胞的感染效率和靶向性是十分必要的。目前主要通过转导水平调控、转录水平调控、翻译水平调控等途径来进行。

基于转导水平调控的肿瘤靶向腺病毒载体。多数肿瘤细胞表面腺病毒受体(CAR)表达不足(Jee.YS，et.al.Anticancer Res.2002，22：2629-34)，因而降低了2型或5型腺病毒载体的转导效率。为了提高转导效率而改变腺病毒外壳蛋白的结构(如鞭毛修饰型AdF35载体(Shayakhmetov DM.et.al.J.Virol.2000，74：2567-83))，使得腺病毒通过结合肿瘤细胞表面高表达的受体，如CD46膜蛋白(Gaggar A.et.al.Nat.Med.2003，9：1408-12)进入细胞，改善其转导效率。

基于转录水平的调控主要应用外源的肿瘤特异性启动子重组腺病毒肿瘤靶向复制表达(Ye X.et.al.Biochem.Biophys.Res.Comm.2003，307：759-64)，然而该方法虽然有较高的靶向性，但表达水平偏低，并且特异性启动子仅能应用于一种肿瘤，随着其分化外源基因的表达水平会降低或消失。

通过成熟mRNA翻译水平的调控获得靶向性基因表达，对外源插入基因进行适当的改造，使得其转录产生的mRNA的5’非编码区或3’非编码区增加一段调节结构，通过基因翻译水平调节将会获得一种针对多种肿瘤细胞的靶向表达系统。

复制溶瘤型靶向腺病毒载体，其部分病毒基因被完全或部分删除货部分突变，现有产品应用。

腺病毒载体早期基因编码蛋白E1A(E1A-12S和E1a-13)和E1B(E1B-55K和E1B-19K)通过激活病毒基因表达和解除调控细胞周期来介导病毒复制。因此用于基因治疗的第一代腺病毒载体(E1A区蛋白表达缺陷型腺病毒)被认为不能在细胞中进行复制(Jones，N.et.al.PNAS.1979，76：3665-9)。然而大量研究表明，第一代腺病毒感染的肿瘤细胞中有病毒早晚期蛋白的表达(Steinwaerder，DS.et.al.Hum.Gene.Ther.2000，11：1933-48；Jane SM.et.al.Ann.Med.1998，30：413-5；Lieber，A.et.al.J.Virol.1996，70：8944-60)，而正常肝脏细胞中没有检测导病毒DNA的复制和早晚期蛋白的表达(Nelson JE.Et.al.J.Virol.1997，71：8902-7)。某些肿瘤细胞蛋白可能代替E1区蛋白的功能，激活了病毒的复制(Jones，N.et.al.PNAS.1979，76：3665-9；Steinwaerder，DS.et.al.Hum.Gene.Ther.2000，11：1933-48；JaneSM.et.al.Ann.Med.1998，30：413-5)。腺病毒DNA的复制导致基因重组，基因重组程度和复制频率成比例，直到感染周期的晚期，腺病毒的基因组都能进行重组(Young CS.Et.al.Curr.Top.Microbiol.Immunol.1995，199：89-108)。