[发明专利]一种用电化学活性开关适配体信标检测蛋白的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种用电化学活性开关适配体信标检测蛋白的方法，属于化学分析方法的技术领域。 

背景技术

分子信标技术是生物分子探针研究的重点。它可以：对PCR扩增产物进行定量检测和对PCR扩增过程(real-time PCR)作实时在线检测[文献：Tyagi，F.R.Kramer，NatBiotechnol，1996，14，303—308；(b)Alsmadi OA，Al-Kayal F，Al-Hamed M，and Meyer BF，BMCMed Genet2006，7，43-49.]；用于基因的定量、定性检测和用于基因点突变等的分析和双链DNA的检测[文献：Du H，Disney MD，MillerBL，Krauss TD，J.Am.Chem.Soc.，2003，125，4012-4013；(d)Marras，S.A.E.，Kramer，F.R.and Tyagi，S.Genet.Anal.Biomol.E，1999，14，151-156；进行基础医学研究和直接应用于临床医学中对肿瘤、SARS、乙肝病毒及艾滋病病毒等各种疾病的检测与诊断[文献：Fan，C.，Plaxco，K.W.，Heeger，A.，J.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2003，100，9134-9137；(f)Douglas Horejsh，Federico Martini，FabrizioPoccia，Giuseppe Ippolito，Nucleic Acids Res，2005，33，e13在医学、分子生物学、环境科学等诸多领域的发展有着非常重要的意义。 

多数分子信标为荧光分子信标。由于荧光分子信标技术需要比较庞大、贵重的检测仪器，不适用于一些比较简陋的工作场所及在野外应对突发事件：如生化袭击等需要野外作业的场合等。而电化学检测技术具有灵敏度高、选择性好、简便价廉和易携带等优点。目前电化学分子信标通常采用以一端固定于电极表面的电化学分子信标。其方法主要是通过改变电化学活性分子与电极表面的距离来实现生物分子/电化学信号的转换[文献：Fan，C.et al.Proc.Natl.Acad.Sci.，2003，100，9134-9137；Wang，J.，Li，J.，Baca，A.J.，Hu，J.，Zhou，F.，Yan，W.，Pang，D.-W.，Anal.Chem.，2003，75，3941-3945；S.S.W.Yeung，  T.M.H.Lee.，I.M.Hsing.，J.Am.Chem.Soc.，2006，128，13374-13375；A.E.Radi，J.L.A.Sa′nchez，E.Baldrich，C.K.O’Sullivan，J.Am.Chem.Soc.，2006，128，117-124.]，具有背景电流高，检测灵敏度低并且需要采用固定的方式，对大容量的样品检测有困难等。 

发明内容

针对已有分析技术存在的不足，本发明的目的在于推出一种用电化学活性开关适配体信标检测蛋白的方法。该方法以电化学活性开关适配体信标为检测探针，无试剂，不需要固定，选择性好、灵敏、简便、快速直接均相测定蛋白等生物分子。 

本发明的目的通过以下技术方案实现。该技术方案包括电化学活性开关适配体信标的合成和检测样品中特定蛋白分子的两个步骤。所述的适配体信标无电化学活性，但与目标分子结合后，因其茎环结构发生改变而具有电化学活性，产生与溶液中的蛋白的浓度呈线性关系的氧化峰电流。由此还可计算蛋白目标分子的含量。 

现详细描述本发明的技术方案。一种用电化学活性开关适配体信标检测蛋白的方法，其特征在于，具体操作步骤： 

第一步电化学活性开关适配体信标的合成 

每1.0OD核酸适配体量合成时取30μL 3.3×10^-3molL^-1的胭脂红酸溶液和加入20mg咪唑，调节该溶液的pH值6.5，室温下羧基活化30分钟，在偶联剂12mgEDC和27mgNHS存在下，加入含1.0OD两端修饰有氨基的具有茎环结构特定序列核酸的核酸适配体PBS溶液，调节该PBS溶液的pH值至7.3和溶液体积为400μL，在冰水浴下搅拌24小时，透析袋于PBS溶液中透析48小时，去除未与核酸偶联的胭脂红酸，用HPLC方法提纯，得到浓度不低于1×10^-5molL^-1的电化学活性开关适配体信标，4℃冰箱中保存备用； 

第二步检测样品中特定蛋白分子