[发明专利]一种结核分支杆菌活菌RNA提取方法及其检测试剂盒

权利要求书

1.一种结核分支杆菌活菌检测方法，其特征在于，它具有快速、高质量提取RNA的方法和检测试剂盒。

2.根据权利要求1所述的RNA提取方法，其操作步骤包括：

①在痰液标本中加入2倍体积的4％NaOH溶液(自备)，吹打均匀后室温放置30分钟使之液化。取约1ml液化痰液，15,000rpm离心10min，吸弃上清，保留50μl左右沉淀，在沉淀中加入1×TE溶液1ml，旋涡振荡10sec，15，000rpm离心10min，吸弃上清，保留50μl左右沉淀，在沉淀中加入1×TE溶液1ml，旋涡振荡10sec，15,000rpm离心10min，吸弃上清，保留5μl左右沉淀。

②在沉淀中加入0.5ml Trizol试剂，旋涡振荡10sec，室温放置5min。

③加入0.1ml氯仿，振荡混匀充分乳化、不分层，4℃15,000rmp离心10min。吸取上清到另一无RNA酶的1.5ml离子管。

④加入等体积的异丙醇，振荡混匀后室温放置10min，4℃15,000rmp离心10min后小心弃去上清。

⑤加入75％冰乙醇500μl，振荡悬起沉淀后于4℃、15,000rmp离心10min，小心弃去上清。干燥5～10min后使乙醇挥发。

⑥沉淀中加入10μl DNase I处理缓冲液(1μl 10×DNase I Buffer、2U的DNase I(RNase-free)和DEPC水)，室温(37℃)孵育15min后；加入1μl的20mM EDTA(RNase-free)，70℃放置5min，4℃13,000rmp离心1min即可进行RT-PCR，或-70℃保存1周左右。

3.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，它具有特异性引物和探针，包括如下序列：

上游引物SEQ ID NO1：5’-CGC GCC CAA GAC GAC TAC A  -3’

下游引物SEQ ID NO2：5’-AGG CCG GGC TGT ACC AGT-3’

检测探针SEQ ID NO3：5’-MAR-TCG GCG GGC AGT CCA GCTTCT-MAR-3’

或者包含有上述序列的向5’端或/和3’端延长的序列；

或者与上述序列同源性大于85％的序列；

或者上述序列的碱基互补序列；

或者使用上述所有序列中的任意一种或一种以上的组合。

4.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，其组成包括：细胞裂解液、水、含有权利要求3所述引物序列SEQ ID NO1-2的RT-PCR反应液、含有权利要求3所述探针序列SEQ ID NO3的检测探针、逆转录酶、DNA聚合酶、参考品、阳性对照和阴性对照。

5.根据权利要求4所述的检测试剂盒的组成，其特征在于，所说的参考品为如下DNA序列SEQ ID NO4：

5’-CGCGCCCAAG ACGACTACAA CGGCTGGGAT ATCAACACCCCGGCGTTCGA GTGGTACTAC CAGTCGGGAC TGTCGATAGTCATGCCGGTC GGCGGGCAGT CCAGCTTCTA CAGCGACTGGTACAGCCCGG CCT-3’。

6.根据权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于，所说的水为无RNA酶的水。

7.根据权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于，所说的阴性对照为无结核分支杆菌活菌的正常人痰液样本。

8.根据权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于，所说的阳性对照为含有结核分支杆菌活菌的患者痰液样本。

9.根据权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于，所说的细胞裂解液由细胞裂解液I和细胞裂解液II组成。

10.根据权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于，每盒中各组分的量为：细胞裂解液I 1瓶24mL、细胞裂解液II 1瓶6mL、无RNA酶的水1瓶2mL、RT-PCR反应液1管210μL、检测探针1管30μL、参考品1管10μL、和阴性对照品1管10μL。