[发明专利]一种EV71病毒荧光RT-PCR检测技术

权利要求书

1.一种EV71病毒荧光RT-PCR检测技术，其特征在于包含一对引物和一条探针，扩增目标片段长度为120bp，引物和探针序列为：

引物1：5`-AGAGATAGCCCTCCCTCTTGAAG-3`(Seq No.1)

引物2：5`-AAGCGCATGTCGGTGAATAGCTCCA-3`(Seq No.2)

探针1：5`-AGATATAACGGGTTACGCGCAAATGCG-3`(S eq No.3)

或者上述引物序列的互补序列，或者上述序列同源性大于75％的序列。

2.根据权利要求1所述的EV71病毒荧光RT-PCR检测技术，其特征在于标记探针5`端的荧光发光基团为可以FAM、TET、JOE、Cy3、Cy5、Cy5.5、Fluorescein、Rhodamine、Rhodamine Red、Rhodamine Green、Rhodamine 6G、Oregon Green 488、Oregon Green 500、Oregon Green 514、Texas Red、TAMRA、Inosine、HEX、FITC、Acridine orange或ROX中任意一种；3`端荧光淬灭基团为DABCYL、DABSYL、Eclipse、TAMRA、BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3或MGB基团中的任意一种。

3.根据权利要求1所述的EV71病毒荧光RT-PCR检测技术，其特征在于使用一步法RT-PCR荧光检测技术，能快速、准确的对临床标本中的EV71病毒含量进行定性或定量分析。

4.根据权利要求1所述的EV71病毒荧光RT-PCR检测技术，其特征在于，使用人工合成的RNA序列作为RNA阳性对照品，序列如下：(Seq No.4)AGAGAUAGCCCUCCCUCUUGAAGGCACACCUAACCCAAAUGGUUAUGCUAACUGGGAUAUAGAUAUAACGGGUUACGCGCAAAUGCGUAGAAAGGUGGAGCUAUUCACCGACAUGCGCUU(120bp)将此人工合成序列稀释至适当浓度梯度，作为EV71病毒RNA的标准品。

5.根据权利要求1所述的EV71病毒荧光RT-PCR检测技术，其特征在于，RT-PCR反应组分包括：10mM Tris-HCl(PH 8.3)、50mM KCl、300uM dNTP、3mMMgCl₂、200nM引物1、200nM引物2、200nM探针1、0.5U AMV酶、0.5U RNaseInhibitor、0.1mg/ml BSA、5mM DTT和1.5U Taq酶，RT-PCR运行程序可以为：先在50℃反应5分钟，然后95℃保温5分钟，再按94℃10秒→60℃35秒循环40次(60℃退火条件下采集荧光信号)。

6.根据权利要求1所述的EV71病毒荧光RT-PCR检测技术，其特征在于，可制备荧光定量RT-PCR检测试剂盒，试剂盒组成包括：

组成成分(20人份/盒)           体积

One step RT-PCR反应缓冲液     380μl

混合酶               60μl

RNA标准品            120μl

RNA标准品            220μl

RNA标准品            320μl

RNA标准品            420μl

DEPC水               1ml

其中，One step PCR反应组分(终浓度)包括：10mM Tris-HCl(PH 8.3)、50mM KCl、300uM dNTP、3mM MgCl₂、200nM引物1、200nM引物2和200nM探针1。混合酶的组成成份(终浓度)包括：0.5U AMV酶、0.5U RNaseInhibitor、0.1mg/ml BSA、5mM DTT、1.5U Taq酶。其中，探针1的5`端标记的发光基团为FAM，在3`端标记的淬灭基团为Eclipse。

7.根据权利要求6所述的EV71病毒荧光RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，操作步骤如下：

PCR反应液的配制：按每人份One step RT-PCR反应缓冲液19ul、混合酶3ul的配方配制PCR反应液，并按22ul/管分装到0.2ml PCR管中，然后加入适量提取好的总RNA并补充DEPC水(RNA标准品直接取8ul)，使反应总体积为30ul，按如下程序进行一步法RT-PCR检测：反应管先在50℃反应5分钟，然后95℃保温5分钟，再按94℃10秒→60℃35秒循环40次(60℃退火条件下采集FAM通道荧光)。