[发明专利]一种核酸等温扩增检测巨细胞病毒的方法及试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及巨细胞病毒核酸扩增检测技术。

背景技术

巨细胞病毒(Cytomegalovirus，CMV)作为一种属于人类疱疹病毒科的DNA病毒，可通过胎盘感染胎儿，引起早产、胎儿发育迟缓、新生儿畸形、黄疸、肝脾肿大、溶血性贫血、视网膜脉络膜炎等疾病症状，新生儿死亡率高；在免疫功能受损者如艾滋病、癌症、器官移植等病人中CMV感染很常见，感染CMV后，可发生进行性间质肺炎、肝炎、脑炎、心包炎及播散性CMV感染等，常威胁病人的生命，影响器官移植的存活。

CMV感染在人类非常普遍，大多无临床症状呈潜伏状态、不会被消除，后天感染有以尿、唾液、乳汁、精液、宫颈分泌物、血液为感染原的接触感染和由于输血或器官移植引起的医源性感染。CMV的特征是在整个生命周期内都潜伏在生物宿主体内，并依据宿主的生理变化和免疫状况由潜伏感染状态活化或再活化，反复周期性发病。在免疫功能受损者如艾滋病、癌症、器官移植等病人中，免疫缺陷是CMV再活化的起因，特别是尽管器官移植成功了，但移植后由于间质肺炎等丧命成了很大问题。因此，对于成为致命原因的CMV感染再活化，确立快速准确的诊断方法对于CMV早期治疗非常重要。

常规的巨细胞病毒病原学检测有病毒分离培养、血清学诊断、抗原检测方法等，其中分离培养需2～3周时间，不能满足早期诊断的需要。血清学检测方法也需等病毒感染后2～3周出现抗体时才有效，并且存在抗体的非特异性反应等问题，存在难以获得满意的灵敏度等缺点。目前外周血白细胞中CMVpp65抗原是公认的出现活化病毒感染的标志，可在出现症状几天至一周内出现阳性，检测灵敏度和特异性均较高，但操作较繁琐、对操作人员要求较高，同时器官移植等免疫受损患者白细胞往往过少，难以进行外周血抗原检测。

近年来，已经可以利用实时荧光聚合酶链式反应(Polymerase ChainReaction，PCR)技术检测CMV DNA，虽然检测灵敏度很高，但检测DNA难以区分病毒的活化和潜伏状态；即使采用实时荧光RT-PCR检测病毒活化时出现的mRNA，但存在核酸提取时残留DNA而mRNA不存在时导致mRNA检测假阳性的危险。目前，国内外研究中采用的CMV mRNA检测靶基因主要是其晚期基因pp67和即刻早期基因IE；对于前者，法国生物梅里埃公司已推出采用基于核酸序列的扩增技术(Nucleic Acid Sequence Based Amplification，NASBA)检测pp67mRNA的产品，临床使用后认为pp67mRNA检测对器官移植患者活化病毒诊断具有较高的特异性，由于pp67属于CMV生命周期中的晚期结构基因，它的转录表示病毒复制已趋完成，因此pp67mRNA阳性患者CMV疾病多已侵及内脏，代表了CMV病已经到了严重程度，这将不利于疾病早期治疗，但对判断CMV疾病预后具有一定的意义；对于后者，IE mRNA是病毒调节基因，研究表明在病毒感染后1小时即能被检测到，或当病毒转入活化期时IE mRNA出现表达，而在潜伏期几乎无表达，它是CMV病毒复制活跃的标志，IE mRNA的表达与活动性感染关系密切，由于其出现比pp67mRNA早，可以作为病毒活动性感染的早期特异诊断指标，在临床移植病人中便于启动先发制人抗病毒方案进行治疗。

RNA核酸等温转录扩增和纳米金探针检测方法(Nucleic Acid Isothermaland Transcriptional Amplification with Gold Nano-particle Probes，NITAG)是一种利用纳米金探针快速检测恒温扩增产物的新型核酸检测技术(原理参见附图1)。具体说来，NITAG技术首先利用一种多酶复合体所具有的逆转录酶、RNase H和依赖DNA的RNA聚合酶活性，在体外等温扩增核酸模板获得大量RNA扩增子，然后纳米金标记的寡核苷酸探针和这些RNA中的靶序列杂交形成伸展的纳米金颗粒-多核苷酸的多聚网络结构，由此引发纳米金粒子光学性质的变化，产生杂交信号以杂交液/板/试纸颜色变化显示，存在相互作用的杂交液/板/试纸显示为蓝色，没有作用的显示为红色。利用该技术，微量RNA模板可通过等温扩增的模板拷贝数和纳米金探针检测的显色信号双级放大而得到检测，该检测技术具有无需特殊昂贵设备、检测灵敏快速、结果直观可见等优点。目前采用NITAG技术检测CMV mRNA的应用尚无公开报道，通过检测可以反映病毒在生物宿主内的活化状态，具有现实的临床意义。

发明内容

所要解决的技术问题