[发明专利]酸性植酸酶APPA,其突变体及其制备

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种植酸酶APPA，其单氨 基酸位点突变体，编码该酶和突变体的基因、及包含这些基因的重组载体和应用。

背景技术

磷是一种所有动物生长都需要的重要矿物质。在动物日粮中提供充足的磷是 非常重要的。长期磷缺乏会导致生长动物的佝偻病和成年动物的骨质疏松症，从而 影响动物的生长性能。目前在动物饲料中添加无机磷如磷酸氢钙来满足动物对磷 的需求。但是在主要以植物性饲料为主的动物日粮中本身就含有丰富的磷，只不过 是因为它们主要以动物不能利用的植酸磷的形式存在而已。

植酸磷是谷物、豆类和油料等作物籽实中磷和肌醇的基本贮存形式，含量高达 1—5％，它占植物中总磷的60—80％。但是，以植酸磷形式存在的磷却因单胃动 物体内缺乏能分解植酸的酶而难以被利用，其利用率仅在0—40％。植酸磷不能 被动物有效利用，从而在饲喂过程中造成了许多问题，第一、造成磷源浪费，一方 面饲料中的磷源不能得到有效利用，另一方面为了满足动物对磷的需求，又必须在 饲料中额外添加无机磷，提高了饲料成本。在实际生产中，添加无机磷时还常因无 机磷中残留有氟、重金属等元素而造成动物中毒。第二、形成高磷粪便而污染环 境，饲料中85％左右的植酸磷会被动物直接排出体外，粪便中大量的磷使水和土 壤受到严重污染。因此，防止磷对环境的污染更具有特殊的意义。第三、植酸磷 还是一种抗营养因子，它在动物肠胃道的消化吸收过程中会与多种金属离子Zn²⁺、 Ca²⁺、Cu²⁺、Fe²⁺等以及蛋白质螯合成相应的不溶性复合物，从而降低了动物对这 些营养元素的有效利用。

植酸酶(EC.3.1.3.8)是一种能水解植酸的酶类。它能将植酸磷降解为肌醇和磷 酸。植酸酶广泛存在于微生物中，如枯草芽孢杆菌、假单孢杆菌、乳酸杆菌、大肠 杆菌、酵母及曲霉等。

植酸酶的饲喂效果已在世界范围内得到了确证。它可使植物性饲料中磷的利 用率提高60％，粪便中磷排泄量减少40％，还可降低植酸磷的抗营养作用。因此 对提高畜牧业生产效益及降低植酸磷对环境的污染有重要意义。

尽管植酸酶的种类和性质多种多样，但是却没有一个真正理想的可用于生产 实践的野生型植酸酶。理论上所谓“理想的”的植酸酶必须具备几个条件：催化效 率高、抗蛋白酶水解、很好的热稳定性并且必须价格便宜等。事实上，这种十全 十美的植酸酶是根本不存在的。这种植酸酶虽然不可能从自然界中找到，但是随 着基因工程和蛋白质工程的发展，现在人们把目光转向人为的制造出这种“理想 的”植酸酶。并且通过基因操作，已经成功地实现了植酸酶的一个或多个性质得 到改善和提高。基于对不同植酸酶晶体结构的研究，利用点突变的方法对植酸酶 进行改造，来提高A.fumigatus植酸酶的比活(Tomschy et al.2000)，提高E.coli植 酸酶的热稳定性(Rodriguez et al.2000)，提高A.niger植酸酶的pH作用范围 (Mullaney et al.2002)。

随着饲料工业的发展，新型植酸酶已经成为饲料添加剂和酶制剂研究的热 点。重点的研究方向之一就是通过基因工程的手段，利用生物反应器来高效表达植 酸酶基因，可望达到大幅度提高植酸酶产量、降低生产成本的目的。

发明内容

本发明的目的是提供一种能高效应用于动物饲喂的新型植酸酶。

本发明的目的之一是提供一种植酸酶APPA，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1 所示。

本发明的目的还在于提供一种核酸分子，其编码权利要求1所述的植酸酶 APPA。实施方式之一中，所述酸分子的序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明的目的还在于提供一种植酸酶的单氨基酸位点突变体，其是由植酸酶 APPA氨基酸序列第22位单位点突变形成的。实施方式之一中，所述氨基酸序列 第22位处的氨基酸突变为苏氨酸(图6)。另一实施方式中，所述氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明的目的还在于提供一种核酸分子，其编码本发明的植酸酶突变体。实 施方式之一中，所述核酸分子的碱基序列如SEQ ID NO.4所示。