[发明专利]木霉磷脂酶A2及表达该酶的基因

说明书

技术领域

本发明涉及木霉磷脂酶A2和表达该酶的基因。同时提供了获得该酶的高效原核表达和亲和标签纯化方法、构建该基因缺失木霉突变子防治玉米弯胞叶斑病的方法。本发明属于农业生物技术领域。

背景技术

磷脂是具有亲水性和疏水性的一类兼性分子，是构成细胞生物膜的主要成分。磷脂酶是可以将磷脂水解为各种磷脂酸和氨基醇的酶，根据磷脂酶对磷脂水解部位的不同可将磷脂酶分为4类：磷脂酶A1、A2、C、D。其中磷脂酶A2(PLA2)特异水解磷脂sn—2位的酯键，产生游离脂肪酸和溶血磷脂，这两个都是细胞重要的信号转导分子。在哺乳动物细胞中，PLA2对激素、生长因子和有关激动剂起反应，参与细胞的抗氧化反应。PLA2可被异三聚体G蛋白、受体酪氨酸激酶、分裂原激活的蛋白激酶(MAPK)和蛋白激酶C(PKC)等调控。

PLA2在真菌侵染寄主中的营养获得，组织侵染，调控寄主内在的免疫反应起着重要的作用。与哺乳动物系统相比，目前为止在真菌中仅有两个PLA2基因获得克隆(Kohler GA.，et al.2006.Phospholipase A2and phospholiapse B activitiesin fungi.BBA，1761：1391-1399.)。木霉是重要的植物生防菌，它主要通过重寄生，诱导植物系统抗病性发挥生防作用，目前还未在木霉中克隆到PLA2基因，更未开展利用克隆基因来调节木霉增强诱导植物抗病性的研究。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种木霉磷脂酶A2及表达该酶的基因，同时提供一种获得该酶的高效的原核表达和亲和标签纯化方法，构建该基因缺失突变子，并应用于植物抗病性研究。

为实现上述目的，本发明利用REMI技术通过标签定位，质粒抢救从木霉中得到一个类似人PLA2的基因，原核表达确认的PLA2活性，为研究PLA2的功能研究和应用奠定了基础。

本发明提供了全新的木霉磷脂酶A2，表达木霉磷脂酶A2(PLA2)的基因，构建高效的原核表达纯化体系，构建了该基因缺失突变子，并使用这种突变子增强对玉米弯胞叶斑病的抗性。

本发明提供了一种木霉磷脂酶A2，它具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。

本发明还提供了一种表达本发明的木霉磷脂酶A2的基因，该基因是以下(a)或(b)的核苷酸序列：

(a)是SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；或

(b)在严谨杂交条件下能与(a)所示的核苷酸序列的互补序列杂交的核苷酸序列，且该核苷酸序列表达具有磷脂酶A2活性的蛋白。

本发明提供了一种高效原核表达纯化木霉磷脂酶A2的方法，包括：

a.使用SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列构建原核表达载体；

b.使用大肠杆菌表达构建的载体；

c.亲和标签柱纯化表达的酶。

本发明还提供了一种构建木霉磷脂酶A2的基因缺失突变子防治玉米对弯胞叶斑病的方法，包括：

a.使用SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列构建基因缺失突变子载体；

b.将构建的缺失突变子载体转化进木霉原生质体；

c.Southern确认木霉原生质体产生同源重组；将缺失突变子单胞分离，硅胶保存；

d.将保存的缺失突变子接种玉米，诱导玉米弯胞叶斑病抗性。

本发明具有突出的实质性特点和重要的科学、经济和社会价值。本发明首次在丝状真菌中获得了木霉磷脂酶A2，克隆了表达该酶的基因，开启了研究该类基因在真菌中功能的先河；提供的获得该酶的高效方法为生产酶制剂提供了可能，该酶所具有的酯酶和磷脂酶A2双功能预示该酶在工业催化上有良好的应用价值；该基因缺失突变子防治玉米弯胞叶斑病的作用为防治玉米弯胞叶斑病的提供了新的应用，可大大减轻玉米弯胞叶斑病病害损失，提高玉米产量。

具体实施方式

以下通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步描述。以下实施例不构成对本发明的限定。

本发明提供的一种木霉磷脂酶A2具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。

本发明提供的一种表达本发明的木霉磷脂酶A2的基因，是以下(a)或(b)的核苷酸序列：

(a)是SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；或

(b)在严谨杂交条件下能与(a)所示的核苷酸序列的互补序列杂交的核苷酸序列，且该核苷酸序列表达具有磷脂酶A2活性的蛋白。