[发明专利]一种可预测原发性肝癌病人手术后肝癌转移复发的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种可预测原发性肝癌病人手术后肝癌转移复发的方法，属于生物技术领域。

背景技术

肝癌是我国第二位癌症死因，手术是目前主要的治疗手段。然而术后高转移复发率(5年复发率达70％，小肝癌也达50％)已成为进一步提高远期疗效的瓶颈，也是攻克肝癌的重要关键。若能对肝癌根治术后的特定人群进行早期转移复发的预测，及时给予干预治疗，做到早发现早治疗，会进一步提高根治性术后复发患者的生存率，也会有很大的社会效益和经济效益。

近年来癌周微环境在肿瘤发生及进展中的作用成为肿瘤研究的热点。许多研究也显示Th1/Th2免疫的失衡与多种肿瘤相关。然而，这方面研究大多都主要集中于基因水平，基因水平研究的明显缺陷是这种变化不一定反应在蛋白水平或功能上。而目前可用于疾病诊断的检测都是以蛋白为基础的。蛋白不像基因那样可以复制，蛋白检测的敏感性就成了关键问题，尤其对低丰度蛋白的检测一直是一个难题，以前的研究表明，细胞因子如：干扰素γ，白细胞介素2，肿瘤坏死因子等很难在组织抽提物中检测到。现有从组织中抽提蛋白的方法由于配方和抽提程序的原因，蛋白多不易溶解，抽提后会大量丢失，另外就是含有大量碱使得抽提物不适合于下游蛋白检测中的抗原抗体结合反应。

目前临床尚无足够敏感和特异的预测指标来预测肝癌术后患者的转移复发以及生存情况，甲胎蛋白、肿瘤大小，包膜有无等虽与转移复发有关但总体来说其预测准确率还很低。

发明内容

本发明的目的是找到一种可预测原发性肝癌病人手术后肝癌转移复发的方法。

为了达到上述目的，本发明的技术方案是提供一种可预测原发性肝癌病人手术后肝癌转移复发的方法，其特征在于，具体步骤为：

第一步：将3-[(3-胆酰氨基丙基)二甲氨基]丙磺酸盐(3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]propanesulfonic acid，CHAPS)、二硫苏糖醇(DL-Dithiothreitol，DTT)、乙二胺四乙酸(Ethylenediaminetetraaceticacid，EDTA)、苯甲基磺酰氟(Phenylmethanesulfonyfluoride，PMSF)、抑胃肽(Pepstatin A)和亮抑蛋白酶肽(Leupe ptin)溶于pH7.0-7.5的磷酸盐缓冲溶液中，使3-[(3-胆酰氨基丙基)二甲氨基]丙磺酸盐终浓度为3-28mM、二硫苏糖醇终浓度为10-80mM、乙二胺四乙酸终浓度为2-35mM的、苯甲基磺酰氟终浓度为0.2-8mM、抑胃肽终浓度为0.5-9.8mM、亮抑蛋白酶肽终浓度为0.5-11mM，配成蛋白抽提液；

第二步：将冰冻的肝癌癌周组织放于液氮中，砸成粉末状，加入第一步得到的蛋白抽提液，混旋器上混匀，其中肝癌癌周组织与第一步得到的蛋白抽提液的用量比为1g:1.8ml-1g:5ml，以功率70-150瓦超声5-7次，每次3-15秒，然后在2-10℃离心30-90分钟，吸取上清液，在20-80℃保存；

第三步：将第二步得到的上清液用pH7.0-7.5的磷酸盐缓冲溶液配成浓度为4ug/ul的溶液，测定其中的白细胞介素2、白细胞介素15和白细胞介素5的浓度，用于预测肝癌患者术后的转移复发和肝癌患者术后的生存或死亡，当白细胞介素2浓度低于25.76pg/ml，白细胞介素15浓度低于37.16pg/ml，或白细胞介素5浓度低于23.173pg/ml，肝癌患者术后易转移复发，当白细胞介素2浓度低于25.76pg/ml，肝癌患者术后易死亡。

在133例患者的癌周组织中白细胞介素2、白细胞介素15和白细胞介素5能较准确地预测肝癌患者术后的转移复发，准确率分别为69.2％、61.7％、61.7％，白细胞介素2还可以预测肝癌患者术后的生存或死亡，准确率为72.9％。

本发明具有以下优点：

1.本发明中组织蛋白抽提液适合于抽提组织中的低丰度蛋白，此抽提方法抽提的蛋白处于合适的PH值范围更宜于蛋白的检测，尤其是应用抗原和抗体结合反应的检测体系，如酶联免疫吸附试验和蛋白芯片。

2.白细胞介素2、白细胞介素15和白细胞介素5明显优于目前用于预测肝癌患者术后复发和生存的临床指标，如甲胎蛋白、肿瘤大小，包膜有无等。而且测定这些白细胞介素简单易行且无创。

附图说明

图1为白细胞介素2、白细胞介素15和白细胞介素5对肝癌患者术后的转移复发的预测情况图；

图2为白细胞介素2的无瘤生存曲线；

图3为白细胞介素2的总生存曲线；