[发明专利]环介导恒温扩增检测米氏凯伦藻的方法

说明书

技术领域

本发明涉及赤潮生物米氏凯伦藻的检测。

背景技术

米氏凯伦藻(Karenia mikimotoi)能产生溶血性(hemolytic)毒素和鱼毒(ichthyotoxins)，能够溶解鱼类细胞，破坏鱼鳃组织结构，使鱼类无法正常呼吸而窒息死亡。由米氏凯伦藻引起的赤潮在墨西哥湾、新西兰、韩国、苏格兰、澳大利亚、日本海域都有发生，2002-2005年在中国福建浙江沿海引发多次赤嘲，对渔业造成巨大经济损失，研究米氏凯伦藻赤潮，进行赤潮的预测预报，对于减少水产养殖业损失，保护海洋生态环境，有着重要的实际意义。

对赤潮进行预测首要问题是对引起赤潮的藻类进行检测，传统的藻类鉴定是通过形态学的观察来划分的，从色素，色素体，贮藏物质等的差别来辨别不同种的藻类细胞，这是一件费时费力的事，而且不同的种属差别很细微，非长期从事该工作的专业人员难以胜任这项工作，并且环境对藻类的形态有很大的影响，鉴定到种存在的困难较多。

目前，利用分子生物学手段检测微藻的方法日渐成熟，这些方法从分子水平解决了某些从形态上难以区分的藻类分类和鉴定问题。自从聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)发明以来，这种技术就被应用到诸多领域。许多学者通过微藻某些基因片段扩增能够对藻类进行鉴定，例如通过对核糖体rDNA序列分析，核糖体间隔区(ITS)的PCR扩增和测序，从而完成对微藻类的种类鉴定，然而这种方法对仪器要求较高，而且所需时间长，一个检测反应需要3小时左右。荧光原位杂交也是近年来微藻鉴定的检测手段，有学者利用核糖体大亚基(LSU)分子探针对墨西哥湾短凯伦藻进行了鉴定，但是这种技术实验材料费用较高。实时荧光定量PCR检测也是近年来微藻检测一个方向，这种方法非常灵敏，所需时间也不长(大约一个多小时)，但是所需的实验仪器(荧光定量PCR仪)价格昂贵。

2000年，日本学者Notomi等开发了一种恒温核酸扩增方法，即环介导等温扩增反应(Loop-mediated isothermal amplificatiom，LAMP)，其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，利用链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在等温条件下保温几十分钟，即可完成核酸扩增反应。此反应不需要模板的热变性、长时间温度循环、繁琐的电泳、紫外观察等过程，而且结果判定简单，既可以利用仪器检测或肉眼观察核酸扩增过程中产生的焦磷酸镁沉淀判定，也可以采用肉眼观察反应液的颜色变化来迅速判定。与以上的检测方法相比，LAMP虽然需要引物多，实验条件需要摸索，但只要在优化好实验条件的前提下，因其操作简单快速、对仪器要求不高、特异性强、扩增效率高、结果判定简单等优点适合快速鉴定和现场检测。这种技术已广泛应用到病原菌检测方面，取得理想的检测效果。

发明内容

本发明需要解决的技术问题是提供一种针对赤潮生物米氏凯伦藻的检测方法。

本发明的技术方案首先提取微藻基因组DNA，以其为模板进行PCR扩增，PCR扩增后对产物进行测序，其特征是针对米氏凯伦藻核糖体间隔区的6个区域设计4条特异性引物，根据LAMP产物产生白色焦磷酸镁沉淀或根据LAMP产物与SYBR Green I反应呈现绿色判断为米氏凯伦藻，所述的4条特异性引物序列如下：

引物Primer     序列Sequence(5’-3’)

F3             CTGTCATCTTGTCATGTGC；

B3             CTAACTTCATGTCATGGAAGG；

FIP(Flc+F2)    TTCAATGCATCAGGGGCAGG-GCAACTGACAGCAGTGTG；

BIP(Blc+B2)    ACACCTTGTGCTTTGTGTGT-TGAAGTGGCAGACAGGAG；

2个内引物FIP和BIP的浓度均为1.6μM，两个外引物F3和B3的浓度均为0.2μM，MgSO4浓度为6mM，dNTP浓度为0.6mM，Betaine浓度为0.6M，反应温度为63℃，反应时间60min。