[发明专利]一种改良十字花科作物耐盐性状的方法

权利要求书

1.一种筛选具有耐盐性状的十字花科作物的方法，该方法包括：

1)将该作物的种子灭菌后，用选自平阳霉素、甲基磺酸乙酯、叠氮钠、硫酸二乙酯、亚硝基乙基脲、5-溴尿嘧啶和马来酰肼的试剂或其组合浸渍10-40小时，取出后用无菌水冲洗；

2)将步骤1)所得种子接种于含NaCl 0.6-1.6％(w/v)的1/2MS培养基上，使其发芽，抽出真叶；

3)将上述抽出真叶的芽切下，接种于1/2MS培养基，待其长至3-6片真叶，遴选正常的芽苗留下；

4)将步骤3)获得的带3-6片真叶的正常芽苗转入含NaCl 0.6-1.6％(w/v)的1/2MS培养基，20-40天后，选取存活的芽苗转入1/2MS培养基进行恢复培养；

5)将经过恢复培养的植株的带3-6片叶的顶芽切下，转入NaCl 0.6-1.6％(w/v)的1/2MS培养基培养20-40天，筛选留下叶色浓绿、茎干健壮的芽苗，转入添加0.1-10mg/L细胞分裂素的1/2MS培养基按株系进行恢复、增殖培养；

6)将经过恢复、增殖培养的耐盐株系的带3-6片叶的顶芽切下，转入添加NaCl 0.6-1.6％(w/v)、0.1-10mg/L细胞分裂素、0.01-5.0mg/L的植物生长素的1/2MS培养基中进行生根培养，20-40天后，观察各株系的生长状况，统计各株系的生根频率，将长势健壮、生根率在70％以上的株系予以保存；和

7)将步骤6)所得株系在添加0.1-10mg/L细胞分裂素的1/2MS培养基增殖、扩繁，以20-30天为一个周期继代培养一次，每2-4个周期后，转入含NaCl0.6-1.6％(w/v)的1/2MS培养基中进行耐盐性筛选，获得耐盐株系。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述十字花科作物是青菜、油菜、白花菜、青花菜、芥蓝或甘蓝。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述试剂的浓度为80-200mg/L，以每粒种子0.5-3ml的量使用。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)、4)-7)中所述含NaCl的1/2MS培养基中，NaCl的含量为0.8-1.2％。 

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤5)-7)中所述细胞分裂素选自6-苄氨基腺嘌呤、6-糠氨基嘌呤、2-异戊烯腺嘌呤、唑重氮苯茎脲和玉米素。

6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤5)中的细胞分裂素是6-苄氨基腺嘌呤和6-糠氨基嘌呤，它们的浓度分别为6-苄氨基腺嘌呤0.1-1.0mg/L和6-糠氨基嘌呤0.1-1.0mg/L。

7.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，步骤6)中所述植物生长素选自吲哚丁酸、吲哚乙酸和萘乙酸。

8.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，步骤6)中植物生长素是吲哚丁酸，其浓度为0.4-0.7mg/L。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于：

步骤2)、4)-7)中所述含NaCl的1/2MS培养基中，NaCl的含量为0.8-1.2％；

所述步骤5)中添加的细胞分裂素是6-苄氨基腺嘌呤和6-糠氨基嘌呤，它们的浓度分别为6-苄氨基腺嘌呤0.2-0.5mg/L和6-糠氨基嘌呤0.2-0.5mg/L；

所述步骤6)中添加的细胞分裂素为6-糠氨基嘌呤，其浓度为0.2-0.5mg/L；

所述步骤6)中添加的植物生长素为吲哚丁酸，其浓度为0.4-0.7mg/L；和

所述步骤7)中添加的细胞分裂素是6-苄氨基腺嘌呤和6-糠氨基嘌呤，它们的浓度分别为6-苄氨基腺嘌呤0.2-0.5mg/L和6-糠氨基嘌呤0.2-0.5mg/L。

10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法为：

1)挑选籽粒饱满、种皮完整的种子，加入吐温-20的0.1％ HgCl2灭菌10分钟，以无菌水冲洗干净后吸干水分，用120mg/L平阳霉素以1ml/粒的用药量浸种24小时，取出后用无菌水冲洗干净；

2)将步骤1)获得的种子接种于含NaCl 0.8％的1/2MS培养基上使其发芽，抽出真叶；

3)将步骤2)抽出真叶的芽切下，接种于1/2MS培养基，待其长至4片真叶，去除玻璃苗和畸形苗，留下正常芽苗；

4)将步骤3)所得的带4片真叶的正常芽苗转入含NaCl 0.8％的1/2MS培养基，25～30天后，选取存活的芽苗转入1/2MS培养基进行恢复培养； 

5)将经过恢复培养的耐盐株系带3～4片叶的顶芽切下，转入NaCl 0.8％的1/2MS培养基培养20～25天，淘汰叶片变黄、萎蔫或茎干玻璃化、水渍化的芽，留下叶色浓绿、茎干健壮的芽苗，转入添加6-苄氨基腺嘌呤0.2mg/L、6-糠氨基嘌呤0.2mg/L的1/2MS培养基按株系进行恢复、增殖培养；

6)将步骤5)经过恢复、增殖培养的耐盐株系将带3～4片叶的顶芽切下，转入添加NaCl 0.8％、6-苄氨基腺嘌呤0.2mg/L、吲哚乙酸0.5mg/L的1/2MS培养基中进行生根培养，20～25天后，观察各株系的生长状况，统计各株系的生根频率，将长势健壮、未出现NaCl毒害现象、生根率在80％以上的株系予以保存并进行繁殖，出现萎蔫、徒长情况或生根率低下的株系则予以淘汰；和

7)将步骤6)所得耐盐株系在添加6-苄氨基腺嘌呤0.2mg/L、6-糠氨基嘌呤0.2mg/L的1/2MS培养基增殖、扩繁，以25天为一个周期继代培养一次，每3个周期后，转入含NaCl 0.8％的1/2MS培养基中进行耐盐性筛选，获得耐盐株系。