[发明专利]用胶体金免疫层析试验检测氯丙嗪的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物工程技术领域的检测方法，具体是一种用胶体金免疫层析试验检测氯丙嗪的方法。

背景技术

氯丙嗪(CPZ，N，N-二甲基-2-氯-10H-吩噻嗪-10-丙胺盐酸盐)是一种良好的镇静剂，对中枢神经机能有良好的抑制作用。在动物的饲料中适量添加可以显著提高日增重，减少饲料消耗，并能作为抗应激药，预防应激综合症和减少运输途中的死亡率。CPZ主要在肝脏代谢，大部分随尿排出，排法缓慢，易产生药物残留。CPZ对人体的神经系统、呼吸系统和循环系统都具有抑制作用，并且可以通过胎盘屏障进入胎血循环。轻微中毒者表现出头晕，嗜睡，乏力，语言不清，视力模糊及轻微呕吐等食物中毒症状。急性中毒者则表现为昏迷、共济失调、呼吸浅漫、昏迷、休克，最后窒息死亡。胎儿、婴儿与老年人对CPZ的代谢明显降低。加入WTO之后，畜禽产品的国际贸易量日益增加，随之对进出口产品的生物安全性的要求也越来越高，为了保证畜禽产品顺利上市和食用者的健康，出入境检疫、海关、生产企业、监督部门等部门迫切需要一种特异、快速、简便的CPZ检测方法。

经对现有技术的文献检索发现，人类临床医学上检测CPZ血药浓度的主要方法为高效液相色谱法。2005年，范盛先在中国兽医学报第25卷第4期名为《猪肾脏中氯丙嗪和异丙嗪残留检测方法的建立》的论文中提出可以采用高效液相色谱法检测猪肾脏中的氯丙嗪，检测过程需提取猪肾中的氯丙嗪，提取出的氯丙嗪经净化和氮气吹干后，用高效液相色谱系统，Hypersil C₁₈柱，UV检测器测定，最低检测限为10ug/kg。2007年陈国征在中国卫生检验杂志第17卷第11期中发表文章《气相色谱法测定尿液中盐酸氯丙嗪》，建立了气象色谱法检测中毒病人尿液中氯丙嗪的方法，最低检测限为0.05ug/ml。2006年路平和2008年许世富分别在中国动物检疫第23卷第7期和现代农业科技第14期中报道了采用气相色谱质谱法测定猪肝、猪肉中的氯丙嗪。但是，上述两种氯丙嗪检测方法不仅需要对检测样品进行一系列严格的预处理，还需要高效液相色谱仪或气相色谱仪等贵重仪器，同时要求有专业的操作人员，不利于现场常规检测使用。目前，国外已有商品化CPZ酶联免疫检测试剂盒，但价格昂贵，大大增加了检测成本，而且操作繁琐，耗时较长。免疫胶体金直接利用特异性抗体检测CPZ，检测对象单一，针对性强，准确率高，检测速度快，只需5—10分钟，操作人员不需经过特殊培训，不仅可以满足检验部门快速、正确地检测CPZ体内残留的要求，而且便于基层推广和运用。胶体金试纸条的监测样品可以以血液或尿液为检测样品，从而保证了在屠宰前对动物体内药物残留检测的需求，能有效避免因宰后肉品检测不合格造成的经济损失。目前国内外均无检测CPZ残留的胶体金快速试纸条出售。

发明内容

本发明的目的在于克服现有方法的不足，提供一种用胶体金免疫层析试验检测氯丙嗪的方法，该方法以与氯丙嗪的多克隆抗体结合的胶体金作为示踪标记物，通过竞争法的胶体金免疫层析方法进行检测，可直接检测样品中的氯丙嗪小分子。

本发明是通过以下技术方案实现的，本发明先将氯丙嗪(CPZ)半抗原通过重氮化反应与对氨苯甲酸连接，再借助苯环上的羧基分别与钥孔血蓝蛋白(KLH)和牛血清白蛋白(BSA)的氨基形成肽键，从而连接形成CPZ偶联物CPZ-KLH和CPZ-BSA。抗原CPZ-KLH用于制备多克隆抗体，抗原CPZ-BSA用于间接酶联免疫吸附实验检测多克隆抗体效价。用胶体金标记多克隆抗体，将其作为示踪标记物。在膜上的检测线(T)上固定抗原CPZ-BSA、质控线上固定抗兔的多克隆抗体，金标抗体与相应的抗原、抗体发生特异性结合被截留而显色，根据检测线、质控线显色与否来判定阴阳性结果。

本发明方法包括如下步骤：

①将CPZ半抗原通过重氮化反应与对氨苯甲酸连接，通过CPZ重氮化合物中苯环上的羧基与KLH和BSA的氨基形成肽键，将CPZ分别连接到KLH和BSA，从而合成CPZ的偶联物CPZ-KLH和CPZ-BSA；

②用步骤①合成的CPZ-KLH完全抗原与等量的弗氏完全佐剂首次免疫新西兰大白兔，采用背部皮下多点免疫法，再用完全抗原与等量弗氏不完全佐剂乳化加强免疫新西兰大白兔三次，每次免疫前耳静脉采血，以CPZ-BSA为包被抗原，用间接酶链免疫吸附试验测抗体效价，效价达到1：10000以上时采血；先后采用硫酸铵沉淀法和亲和层析法纯化血清中的抗体IgG，获得抗CPZ的多克隆抗体；

③用柠檬酸三钠还原法制备胶体金；