[发明专利]人免疫缺陷病毒Ⅰ型的人工假病毒及其制备和应用

说明书

技术领域

本发明涉及人免疫缺陷病毒I型的人工假病毒。

背景技术

艾滋病全名为人免疫缺陷综合症，其病原体为人免疫缺陷病毒(Human ImmunodeficiencyVirus，HIV)，是一种生存于人的血液之中并能够破坏人体免疫系统，进而使人体失去对其它疾病的抵抗能力，引发不可治愈的感染和肿瘤，最终导致被感染者死亡的病毒。其中，HIV-1为主要的流行和致病亚型。

HIV检测时，有以下三个主要步骤需要阳性参照：

1.从标本中提取HIV RNA，包括：病毒外膜、核衣壳打开/破碎，核酸释放。

2.HIV RNA被逆转录(也称反转录)为cDNA。

3.cDNA与PCR反应液和DNA多聚酶混合，在PCR仪中扩增并得到信号。

现有的阳性参照，主要有下述几种来源：病人血液(/血制品)；体内或体外转录RNA；质粒或化学合成。

所有阳性参照中，最准确贴切的阳性参照应该是含该HIV病毒的天然样本(如病人血液、淋巴)，其同质性可充分保证其作为前述三个步骤的阳性参照，但其缺陷在于天然样本来源少，且由于含有天然病毒，因此具有传染性和危害性。

要克服天然病毒来源少且具有传染性的缺点，本质上可通过离体培养来解决，即把HIV(尤其是基因组经过无害化改造的HIV)导入合适的人工培养宿主细胞系，重组HIV颗粒即可从细胞中产生并分泌至培养基上清。然而，该技术的关键步骤为保密状态，目前只为少数实验室所拥有；另一方面，这种HIV生产方法可能尚存在若干缺陷，如成本高、病毒数量仍然较低、结构不天然、重复性差等。

体外转录的HIV RNA，因为它与标本中待测指标一样，都是RNA，因此可以作为逆转录的阳性参照；但是，由于其不具备病毒外壳，因此不适合作为从标本中提取病毒RNA操作的阳性参照。

用含HIV DNA序列的质粒作为阳性参照，其优点是制备纯化容易，但由于质粒是闭合环状超螺旋双链形式，非单线性，也不是RNA，因此它只能作为PCR参照，而无法作为RNA提取和逆转录的参照。

而采用化学合成制备的HIV RNA阳性参照，目前技术尚不成熟，且成本高，还会因为没有核衣壳、膜的保护而容易降解，因此到目前为止还无实际应用的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种易于获得，安全，廉价的人免疫缺陷病毒I型(HIV-1)的人工假病毒，其制备及应用。

假病毒即指反转录病毒载体，为经过基因改造的反转录病毒，具有原始病毒的基本结构和部分生活史，而不具有多数调节基因及主要致病成份。所谓基本结构，乃假病毒的外膜蛋白及脂类、衣壳蛋白、复制酶(起切割、逆转录、整合作用的蛋白)、RNA基因组，分别由来源于天然病毒的env、gag、pol、目的基因(序列)所编码/代表。所谓部分生活史，乃假病毒仅可在宿主细胞中产生组件并组装，且只能一次性地感染靶细胞，不产生新病毒。

本发明利用反转录病毒系统(Clontech公司的RetroX^(R) system)，将经筛选获得的目的DNA片段重组(分子生物学常规技术)入pLXSN(plasmid-LTR-X-SV40 promoter-Neomycin)质粒载体，然后导入(方法：脂质体转染)病毒生产细胞(Clontech公司的PT67)，携带目的序列(以RNA形式)的假病毒便可以从生产细胞中产生，分泌到液态的培养基中。收集此培养基，2000RPM离心10分钟去除大部分细胞碎片和杂质，就得到假病毒粗制品。