[发明专利]肿瘤转移相关基因骨桥蛋白的多态性和单体型构建及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一促癌基因骨桥蛋白的单体型及用于预测原发性肝癌病人预后的试剂盒， 属于基因工程领域。

背景技术

现有技术公开了骨桥蛋白基因与原发性肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)复 发转移相关。骨桥蛋白(Osteopontin，OPN)，又称Secreted phosphoprotein I，SPPI； Bone sialoprotein I，BNSP或BSP I；EarlyT-lymphocyte activation-1，ETA-1。它最 初由Senger于1979年在转化的恶性上皮细胞中发现的一种分泌性的非胶原磷蛋白。具有趋 化因子样活性，属于SIBLING家族成员。在人、鼠、猪、牛、鸡等不同物种中均表达骨桥 蛋白，而且不同物种的骨桥蛋白cDNA均含有高度一致性序列：包括氮端、碳端、凝血酶 作用位点(thet hrombin cleavage site，RSK)、甘氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨 酸(GRGDS)序列。人骨桥蛋白(hOPN)是一种磷酸化、带负电荷、具有亲水性的酸性分泌糖 蛋白，由一个单一基因编码，定位于染色体4q13位点上，含有7个外显子和6个内含子，延 伸至大约8千碱基对核昔酸序列，编码314个氨基酸，广泛存在于骨、牙质、牙骨质、软骨、 肾脏、血管等不同组织，在巨噬细胞、淋巴细胞和乳腺中特异的上皮细胞中发挥活性；参 与骨组织的矿化与重建、动脉粥样硬化、抗感染、免疫调节、缺血-再灌注损伤等过程。 近年来，骨桥蛋白与肿瘤的发生发展，特别是它与肿瘤转移的关系日益引起人们的关注。 骨桥蛋白通过与不同的整合素和CD44受体相互作用调节肿瘤相关信号通路，阻断细胞周 期，抑制细胞凋亡，促进细胞存活、基质降解和重塑、细胞迁移、免疫逃逸和血管形成， 最终导致肿瘤的发生、发展。

单核苷酸多态性(SNP)是在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的一种DNA序 列多态性，是人类基因组中最常见的遗传变异，为第三代分子遗传标记。因为单个单核苷 酸多态性本身的功能有限、利用单个位点单核苷酸多态性分析评价骨桥蛋白基因作用是不 够全面的，它提供的信息量也较少。已有研究发现，由于单核苷酸多态性之间存在连锁不 平衡，位于同一条染色体上相邻的单核苷酸多态性等位基因往往倾向于同时出现，并以一 个整体遗传给后代。而这些位于一条染色体特定区域的一组相互关联并倾向于以整体遗传 给后代的单核苷酸多态性的组合即为单体型。它决定了基因的功能单位和人群遗传变异的 内在特征。单体型的存在可以极大地减少疾病关联研究的工作量，在肿瘤侯选基因研究具 有重要的作用。

发明内容

本发明的目的是提供一促癌基因骨桥蛋白的单体型及用于预测原发性肝癌病人预后 的试剂盒。

为了达到上述目的，本发明的技术方案是提供一种用于预测原发性肝癌病人预后的试 剂盒，其特征在于，由纯化系统、扩增系统、单核苷酸多态性位点检测系统、5’→3’引 物序列，3’→5’引物序列及测序引物组成；

其中，纯化系统由蛋白酶K、苯酚、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、乙二胺四乙酸、核糖 核酸酶和无水乙醇组成；

扩增系统由脱氧腺苷三磷酸、脱氧鸟苷三磷酸、脱氧胞苷三磷酸、胸腺嘧啶核苷三磷 酸、高保真酶、水、聚合酶链式反应缓冲液、氯化镁、模板DNA组成；

单核苷酸多态性位点检测系统由DNA 多聚酶、腺苷三磷酸、荧光素酶、腺苷三磷酸双 磷酸酶、腺苷酰硫酸和荧光素组成；

5’→3’引物序列为CAGAAATGCTGCCATCGTGTG、ATAGGTAGGCTGGGCGATTT、 ATAGGTAGGCTGGGCGATTT和TGAATGCCCATCCCGTAA；

3’→5’引物序列为ACATACCCGCATAAGCGTGTC、GAGCCAGAAGGCTATTGTTCA、 GAGCCAGAAGGCTATTGTTCA和ATGAGGTTTTCTGCCACTGC；

测序引物为GAGTAAACTACAGTAAATCC、CTCTCAAGCAGTCATCC、AAAGGACAGAGGCAAGT和 ATTGTGTGTGTGCGTT。

所述试剂盒配合骨桥蛋白单体型构建软件系统使用。