[发明专利]近拟鹿角灵芝种菌株或子实体特异分子标记及获得方法与应用

权利要求书

1.一种Ganoderma subamboinense种菌株或子实体的特异性分子标记，其特征在于：该标记是一种基因SCAR分子标记，是PCR扩增后为461bp的特异DNA片断，其PCR扩增引物对序列为5′tcgcgaagcgggctctttact 3′和5′ggtcataaagctgtccaaacg 3′。

2.Ganoderma subamboinense种菌株或子实体的特异分子标记的获得方法，包括步骤：

I.菌株或子实体基因组DNA的提取

(1)菌株基因组DNA的提取

将4-6℃的Ganoderma subamboinense菌种转接到PDA斜面上，26-28℃培养活化，5-7天后转接到马铃薯葡萄糖培养液中，26-28振荡培养10-14天，收集菌丝，用LETS法提取基因组DNA；

(2)子实体基因组DNA的提取

将子实体1-2g剪碎，用体积比为1∶2-3的95％V/V酒精和0.5mol/L EDTA·Na₂混合物浸泡处理20-30小时，过滤，水冲洗，研磨粉碎后，加入800-1000μL pH 8.0CNETS溶液分装于2ml离心管中，60-70℃保温1-3小时，10000-12000g离心2-5min后，取上清，按照酚/氯仿法提取子实体基因组DNA，其中的CNETS溶液组成是1％m/V CTAB、1mol/LNaCl、10m mol/L EDTA、20m mol/L Tris-Cl、1％m/V SDS；

II.Ganoderma subamboinense种及灵芝属其他种的菌株或子实体ITS片段的获得、测序及序列比对

用ITS-PCR法，其中ITS引物对为ITS1F：5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’；ITS4：5‘-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’，得Ganoderma subamboinense种及灵芝属其他种的菌株或子实体ITS片段；然后测序并比对各个灵芝属种的代表性的序列。

III.特异性PCR引物的获得

根据ITS序列的比对结果，找到Ganoderma subamboinense的ITS序列上特异性的结合位点，利用Primer Premier5.0设计出特异性PCR引物对为5′tcgcgaagcgggctctttact 3′和5′ggtcataaagctgtccaaacg 3′；

IV.用特异PCR扩增引物对对Ganoderma subamboinense种菌株或子实体的基因组DNA进行PCR扩增

V.琼脂糖凝胶电泳检测。

3.根据权利要求2所述的Ganoderma subamboinense种菌株或子实体的特异分子标记的获得方法，其特征在于：所述步骤I(1)中所述的LETS提取法：

①将冻干的菌丝大约20-30mg置于预冷的无菌研钵中迅速研磨成细粉，后迅速向研钵中加入1000ml已配置好的LETS缓冲液，分装于2个1.5ml的离心管中；

②向每个管中加入600-800μL的苯酚∶氯仿异∶戊醇PCI比例为25∶24∶1上下颠倒，充分混匀，4-10℃16000g离心8-15分钟；

③轻轻吸取上清于新的离心管中，加入500μL的PCI，4℃16000g离心8-15分钟；

④重复步骤③，直到两相的界面没有杂质为止；

⑤取上清，向上清液中加入2倍体积的已-20℃预冷的无水乙醇或95％乙醇，轻轻混匀，置于-20℃冰箱中静置5-10分钟；

⑥取出，4℃16000g离心10-15分钟；

⑦倒去上清，再向管中加入500μL预冷的70％V/V乙醇，用指头轻轻敲打沉淀使其溶解，静置一会儿，4℃16000g离心10分钟；

⑧重复步骤⑦1次；

⑨倒去上清，待管中酒精挥发后，加入适量体积的TE缓冲液pH8.0，按100mlTE缓冲液加入2μL 1mg/ml的DNase-free RNase；37℃温浴1-2个小时；

⑩将获得的基因组DNA经过ITS-PCR扩增后再通过1.0％琼脂糖凝胶电泳、检测，以确定其质量是否满足试验需要。